《Plant Physiology and Biochemistry》：Genome-wide identification of the carotenoid cleavage dioxygenase gene family in wheat and analysis of the TaDREB-7A–TaNCED9a regulatory module conferring drought tolerance
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类胡萝卜素裂解双加氧酶（CCD）在植物生长、发育和非生物胁迫响应中发挥关键作用，但其在小麦中的全基因组鉴定及干旱响应机制仍待阐明。研究人员在小麦中鉴定出34个TaCCD基因，分布于15条染色体，系统发育上分为5个亚族。基因结构分析表明各亚族成员具有保守基序和相
类胡萝卜素裂解双加氧酶（CCD）在植物生长、发育和非生物胁迫响应中发挥关键作用，但其在小麦中的全基因组鉴定及干旱响应机制仍待阐明。研究人员在小麦中鉴定出34个TaCCD基因，分布于15条染色体，系统发育上分为5个亚族。基因结构分析表明各亚族成员具有保守基序和相似的内含子-外显子排列。顺式作用元件分析提示这些基因参与胁迫适应、发育进程和激素信号。三级结构预测与蛋白互作网络揭示了TaCCD蛋白独特结构特征及潜在互作伙伴。TaNCED9a在小麦根系中转录水平最高且受干旱显著诱导，亚细胞定位于叶绿体。下调TaNCED9a导致小麦抗旱性降低，伴随活性氧积累和内源脱落酸（ABA）水平下降。通过酵母单杂交、双荧光素酶和烟草瞬时共表达实验，研究人员鉴定到上游调控因子TaDREB-7A可调控TaNCED9a表达。此外，研究人员开发了KASP分子标记以鉴别优势单倍型TaNCED9a-HapI，该单倍型在干旱下发芽率显著高于TaNCED9a-HapII且在小麦中占主导。上述结果深化了对小麦TaCCD家族干旱响应机制的认识，并为分子育种改良抗旱性提供了遗传资源。
研究背景与立项依据
小麦（Triticum aestivum L.）是全球约20%热量摄入的来源，然而水分亏缺可使产量损失超过20%，气候变暖进一步加剧干旱威胁。类胡萝卜素裂解双加氧酶（carotenoid cleavage dioxygenase，CCD）依赖保守的RPE65结构域，其中9-顺式类胡萝卜素裂解双加氧酶（9-cis carotenoid cleavage dioxygenase，NCED）亚族专一裂解9-顺式环氧类胡萝卜素生成黄质醛（xanthoxin，C15），是脱落酸（abscisic acid，ABA）合成的关键步骤。尽管CCD家族在拟南芥、水稻、玉米等作物中已有报道，小麦TaCCD的全基因组鉴定及其在干旱下的NCED调控轴仍属空白。为此，研究人员系统鉴定小麦TaCCD家族，聚焦TaNCED9a解析其功能和上游调控，并挖掘抗旱优势单倍型，服务于标记辅助育种。该文发表于《Plant Physiology and Biochemistry》。
主要技术方法概览
研究人员以中国春小麦（Chinese Spring）为材料，结合PEG 6000模拟干旱处理与多组织采样；利用Ensembl Plants参考基因组与Pfam PF03055隐马尔可夫模型（hidden Markov model，HMM）筛选并经CDD/Pfam双库验证获得34个TaCCD；通过WheatOmics和自测RNA-seq/qRT-PCR分析表达；采用Swiss-Model预测三级结构、STRING预测互作；利用BSMV-VIGS（barley stripe mosaic virus-induced gene silencing）沉默TaNCED9a并结合生理指标（MDA、脯氨酸、SOD、CAT、POD、ABA-ELISA）评价抗旱性；以酵母单杂交从PEG处理叶片cDNA文库筛获TaDREB-7A，经双荧光素酶（dual-LUC）与烟草ProTaNCED9a:GUS共表达验证；基于WheatUnion重测序2627份种质锁定启动子-1943 bp SNP，开发KASP标记在100份中国小麦种质中分型，并做发芽率关联分析与时空分布统计。
研究结果
3.1 TaCCDs的全基因组鉴定与染色体定位
经HMMER与严格域筛选，研究人员命名34个TaCCD（含TaCCD1a-g、TaCCD4a-c、TaCCD7a-c、TaCCD8a-l、TaNCED2a-b、TaNCED3a-c、TaNCED6、TaNCED9a-c），不均分布于15条染色体（1A/1B/1D/4D/7A/7B/7D无成员），5D最多（6个）。
3.2 TaCCDs系统发育分析
联合拟南芥（9）、水稻（11）与小麦（34）构建NJ树，小麦TaCCD归为CCD1/CCD4/CCD7/CCD8与NCED五支，六倍体扩增使多数拟南芥/水稻CCD对应3个小麦同源基因。
3.3 内含子-外显子与保守基序
NCED亚族（除TaNCED3b、TaNCED6）仅1个外显子；CCD1类14个外显子，CCD4类1个。MEME检出10个基序，Motif 2/5/7/8/9全员共有，Motif 1/6缺席TaCCD7a-c，各亚族结构内部高度保守。
3.4 启动子顺式元件
2000 bp上游区富集发育（RY-element）、胁迫（MBS、LTR、G-Box）、激素（ABRE、TGACG-motif、CGTCA-motif、P-box）三类元件，提示TaCCD整合发育-胁迫-激素信号。
3.5 RNA-Seq表达谱
干旱1 h/6 h下NCED亚族（除TaNCED3a-c、TaNCED6）普遍上调；TaNCED9a、TaNCED9b、TaNCED9c、TaNCED2a、TaNCED2b、TaCCD8i在干旱下高表达，qRT-PCR证实TaNCED9a在PEG 6000处理12 h达峰且根中基础表达最高。
3.6 三级结构与互作预测
Swiss-Model显示TaNCED9a/b/c具经典α/β折叠核与长柔性延伸区；STRING预测TaCCDs与β-胡萝卜素异构酶D27（IP1-3）及番茄红素β-环化酶（IP4-5）互作，指向类胡萝卜素代谢协同。
3.7 qRT-PCR验证
六基因均受干旱诱导，TaNCED9a在12 h表达量居首，支撑其为核心候选。
3.8 TaNCED9a组织定位
TaNCED9apro:GUS拟芥转基因显示根、茎、叶、花药均有信号，qRT-PCR确认根中最强。
3.9 亚细胞定位
35S:TaNCED9a-GFP在本氏烟叶片与叶绿体自发荧光共定位，确认叶绿体定位。
3.10 TaNCED9a功能验证
BSMV-VIGS沉默后，缺水14天表型萎蔫加重；MDA升高，SOD/CAT/POD与脯氨酸下降，内源ABA降低，证明TaNCED9a正向调控抗旱。
3.11 沉默导致ROS清除与ABA累积受损
生理数据表明下调TaNCED9a削弱ROS清除能力并减少ABA合成，连通NCED-ABA-ROS轴。
3.12 TaDREB-7A调控TaNCED9a
酵母单杂交从1.2×106转化子筛得TaDREB-7A；双LUC中LUC/REN显著升高；烟草GUS共表达增强，确认TaDREB-7A直接激活TaNCED9a启动子。
3.13 优势单倍型TaNCED9a-HapI
2627份WheatUnion种质启动子+编码区检获10 SNP，-1943 bp界定HapI（CC）/HapII（TT）；KASP在100份中国种质分型显示HapI干旱发芽率显著更高（P<0.05），在北方冬麦区、西北春麦区、新疆冬春麦区等旱区频率占优，且1950s起育成种持续选择HapI。
讨论部分总结
研究人员指出小麦TaCCD扩增至34个，NCED亚族结构简并且短期干旱上调，符合ABA通路保守性。TaNCED9a定位于叶绿体、沉默致ABA与抗氧化酶双降，首次在小麦确立DREB-NCED调控轴（TaDREB-7A→TaNCED9a→ABA/ROS），与拟南芥DREB2C-AtNCED9、花生AhDREB1-AtNCED1等跨物种保守。启动子-1943 bp SNP落于ABRE的ACGT核心，可能改变AREB/ABF结合亲和；HapI受长期人工选择，KASP标记可转入分子育种。作者也明示局限：VIGS瞬时沉默需CRISPR或稳定转化复验；HapI优势仅基于室内PEG发芽，缺田间渐进干旱与多生育期数据，后续需多年多点区试。
结论翻译
综上，研究人员通过生物信息学在小麦中系统鉴定34个TaCCD基因；其中叶绿体定位的TaNCED9a通过调控ROS与ABA水平正向介导抗旱性；TaDREB-7A作为上游转录因子直接调控TaNCED9a；针对优势单倍型TaNCED9a-HapI开发的KASP标记为抗旱小麦标记辅助育种提供了工具。
