经过优化激活特性的抗CD3价态控制机制，实现了用于实体瘤免疫治疗的多特异性纳米抗体的组合发现

《Science Bulletin》：Activation-optimized anti-CD3 valency control enables combinatorial discovery of multi-specific nanoantibodies for solid tumor immunotherapy

　　

摘要

能够结合CD3以重新定向T细胞的多特异性抗体在血液系统恶性肿瘤的治疗中带来了显著的临床益处，但其在实体瘤中的应用仍受到狭窄的治疗窗口和固定的分子几何结构的限制，这限制了系统的优化。在这里，我们使用了一个模块化的纳米适配器框架来调整抗CD3（αCD3）的表面价态，同时保持了抗体的亲和力、总抗体负载量和肿瘤靶向能力。通过调整αCD3的化学计量比例，我们找到了一个经过优化的构象，既能保持针对肿瘤的细胞毒性，又能减少非特异性免疫激活和T细胞耗竭。该平台使我们能够快速筛选出91种四特异性纳米抗体构型，这些构型整合了免疫检查点阻断、共刺激信号传导和先天免疫调节功能。领先的候选抗体在体外实验中增强了免疫系统与肿瘤的相互作用，促进了肿瘤内的免疫浸润，并在周血单核细胞（PBMC）人源化的小鼠模型中抑制了肿瘤生长，且耐受性良好。这些发现表明，抗CD3价态控制与模块化组合组装相结合是一种潜在的有价值且可扩展的策略，可用于开发针对实体瘤的多特异性免疫疗法。

引言

多特异性抗体免疫疗法通过在一个治疗方案中同时结合肿瘤相关抗原和免疫效应分子，扩展了基于抗体的癌症治疗方法 [1]、[2]、[3]。在这些制剂中，含有抗CD3（αCD3）结合域的T细胞重定向抗体特别有效，因为它们能够将细胞毒性T细胞与肿瘤细胞连接起来并触发靶向杀伤 [4]、[5]、[6]。CD3是将T细胞受体激活转化为细胞毒性程序的关键枢纽 [7]。然而，这种效力在实体瘤治疗中却带来了狭窄的治疗窗口 [8]。CD3的结合必须足够强以启动肿瘤杀伤，但过度或系统的激活会导致细胞因子释放、肿瘤外毒性以及T细胞快速耗竭 [9]、[10]、[11]、[12]、[13]。在T细胞重定向免疫疗法中，平衡针对肿瘤的细胞毒性与受控的免疫激活仍然是一个核心挑战 [14]、[15]、[16]。

目前大多数策略通过调整αCD3域的固有结合亲和力来解决这一挑战 [17]。与CD3结合亲和力较低的分子可以减少系统激活，在设计T细胞结合抗体时已被广泛探索 [14]。然而，实体瘤还存在其他挑战，包括T细胞浸润受限、间质限制以及抑制性的免疫微环境 [18]、[19]、[20]、[21]。在这种情况下，过度减弱CD3结合可能会降低抗肿瘤活性，而增加剂量或高亲和力结合则可能增加系统免疫激活和肿瘤外毒性的风险 [18]、[22]、[23]、[24]、[25]、[26]。这种权衡表明，除了亲和力工程之外，一个能够独立控制αCD3识别的参数对于治疗开发来说将是非常有价值的。理想情况下，这将能够在保持肿瘤靶向能力的同时，减少导致依赖亲和力的系统激活的有效αCD3表面价态 [23]、[27]、[28]。然而，基因编码的多特异性抗体具有固定的几何结构和化学计量比，这限制了相对于肿瘤靶向的αCD3呈现的独立控制。

这种结构限制也限制了更高阶免疫结合配置的优化 [29]、[30]。有效的实体瘤免疫疗法可能需要对多种途径进行协调激活，以克服肿瘤介导的抑制作用，包括检查点阻断、共刺激和先天免疫调节 [31]、[32]、[33]。更广泛地说，新兴的癌症治疗策略越来越强调新型免疫治疗靶点、先进的递送系统以及合理设计的协同组合 [34]。当CD3结合无法独立于抗体亲和力或分子形式进行调整时，过度激活可能会掩盖各个免疫调节成分的贡献，并阻碍协同作用的合理分析。此外，每种基因编码的抗体形式都需要重新格式化、表达和纯化 [35]、[36]、[37]，这使得全面探索多臂组合变得不切实际 [38]。因此，该领域需要一个平台，能够在保持抗体亲和力的同时，定量调节CD3的呈现，并实现多种免疫调节成分的模块化整合。

我们认为，表面价态控制可以为传统的CD3亲和力调节提供一个补充层。这种策略不是通过改变每个αCD3分子的结合强度，而是基于调整颗粒支架上可用的αCD3分子的数量。高亲和力识别可以确保有效的T细胞结合 [39]、[40]、[41]，而降低的呈现密度则限制了由亲和力驱动的系统激活。重要的是，价态控制并不是为了替代亲和力工程；相反，αCD3亲和力和αCD3表面呈现是相关但不同的参数，可以结合起来微调T细胞结合和激活 [42]。这种定量控制可以支持系统的组合优化，而这使用传统的蛋白质工程是难以实现的。

在这里，我们采用了一个Fc结合的纳米适配器框架 [43] 来调节αCD3表面价态，并开发了一种多特异性纳米抗体（Multi-NanoAb），而无需对每个抗体构件进行基因工程改造。通过调整αCD3的化学计量比例并验证颗粒上的负载量，我们定义了一个经过优化的基线，该基线在保持抗肿瘤能力的同时减少了非特异性细胞毒性和T细胞耗竭（图1a）。然后我们使用这个校准过的基线来组装和筛选91种结合了检查点阻断、共刺激激活和先天免疫调节的四特异性配置。候选分子增强了肿瘤与免疫系统之间的相互作用，促进了肿瘤内的免疫激活，并在周血单核细胞（PBMC）人源化肿瘤模型中实现了肿瘤抑制，同时具有良好的短期耐受性（图1b）。总体而言，这项工作建立了一个可扩展的免疫工程平台，将Multi-NanoAb的优化重新定义为一个定量组装问题，使得抗CD3价态控制成为可能的优化手段，从而加速了针对实体瘤的免疫疗法的组合发现。

章节片段

纳米适配器的制备和表征

基于融合蛋白/聚合物的纳米适配器（FP-NAs）是根据已建立的方案合成的 [43]。通过动态光散射（DLS）使用颗粒大小分析仪测量了它们的流体动力学直径和多分散性指数（PDI）。FP-NA的形态通过场发射扫描电子显微镜（FE-SEM）进行了观察。简要来说，将2 μL的FP-NA悬浮液（1.5 μg/mL）滴涂在硅片上，并在室温下空气干燥。样品随后用金溅射涂层30秒

FP-NAs实现了抗体的定量负载和Multi-NanoAb的可编程组装

为了建立一个适合基于抗体的免疫疗法和体内应用的模块化纳米适配器平台，我们工程化了一种人FcγR1-人血清白蛋白融合蛋白（hFcγR1-HSA）。FcγR1的胞外域通过一个灵活的（G4S）3连接子与HSA连接，并在C端附加了一个组氨酸标签。纯化后，Western blotting证实了融合蛋白的完整性（图2a）。随后使用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和高效...

讨论与结论

本研究介绍了一个基于FP-NA的模块化NanoAb平台，该平台能够精确调节αCD3表面呈现，以实现针对T细胞招募的多特异性纳米药物。通过解耦αCD3的化学计量输入、颗粒负载量和有效的表面呈现，该平台允许系统地优化T细胞激活阈值，而不会损害αCD3抗体的固有亲和力。我们的发现表明，αCD3表面价态与抗体亲和力是不同的：

利益冲突

作者声明没有利益冲突。

致谢

本研究得到了中国国家自然科学基金（52130301、52522306和32271444）和广州市GJYC计划（2024D03J0001）的支持。

作者贡献

宋 Shen和Wang Jun领导了这个项目。Zhu Long、Song Shen和Wang Jun构思了这项研究并监督了工作。Zhu Long进行了实验。Ma Ya-Jing、Kang Jian-Kang、Che Xiu-Hai、Zhao Dong-Kun、Cai Yin-Yi和Yu Yao-Ru协助了体外和体内实验。Zhu Long和Song Shen分析了数据。

Long Zhu|Ya-Jing Ma|Jian-Kang Kang|Xiu-Hai Che|Dong-Kun Zhao|Yin-Yi Cai|Yao-Ru Yu|Song Shen|Jun Wang