一种基于适配体功能化金属有机框架的3D打印提取装置，用于检测酒精饮料中的赭曲毒素A

《Talanta》：A 3D-printed extraction device based on aptamer-functionalized metal–organic frameworks for ochratoxin A determination in alcoholic beverages

　　

本工作报道了一种涂覆适配体功能化金属有机框架（Apt@MOF）的3D打印提取装置的开发，用于从酒精饮料中选择性提取赭曲霉毒素A（OTA）。研究人员最初在分散固相萃取（dSPE）条件下筛选了多种MOF，确定UiO-66-(COOH)₂为最合适的载体，因其对OTA具有最小的非特异性保留，从而最大化了基于适配体识别的贡献。在通过物理吸附将适配体固定到MOF上后，所得杂化材料对OTA表现出高选择性，并成功通过聚偏氟乙烯（PVDF）基涂层固定到聚丙烯（PP）3D打印装置上。优化后的系统提供了高回收率（91–95%）、良好的重现性（RSD ≤ 5.5%）以及0.06 μg L^-1的检测限，富集因子为4。该方法在葡萄酒和啤酒样品中的应用得到了验证，显示出高效的基质净化能力和可靠的OTA定量能力。适配体介导的识别、MOF支撑的固定化与3D打印的功能多样性相结合，为从酒精饮料中选择性提取OTA提供了一种实用、低成本（每个装置约0.49欧元）且一次性使用的替代方案。

**基于适配体功能化金属有机框架的3D打印提取装置在酒精饮料中赭曲霉毒素A测定中的应用**

**1. 研究背景与问题提出**

真菌毒素污染是食品安全和公共卫生领域面临的重大挑战之一，赭曲霉毒素A（OTA）是由曲霉属（*Aspergillus*）和青霉属（*Penicillium*）产生的分布最广、毒性最强的污染物之一。OTA常见于谷物、咖啡、葡萄酒、干果及其衍生制品中。由于其高化学稳定性、对热加工的耐受性以及环境持久性，OTA可在食物链中持续存在。此外，其毒理学特征包括肾毒性、免疫毒性、神经毒性、致畸性及潜在致癌性，加之其较长的生物学半衰期和生物蓄积倾向，危害更为严重。因此，各国监管机构对食品中OTA设定了极低的最大限量。欧盟委员会条例(EU) 2023/915对不同食品类别制定了具体限量，例如针对婴幼儿食品的最严格限量为0.5 μg/kg，谷物制品为2-4 μg/kg，非酒精麦芽饮料和啤酒为3 μg/kg，葡萄酒和果酒（含起泡酒）限量为2 μg/kg。这些广泛而严格的限量要求凸显了开发高灵敏度、高选择性分析方法的必要性，以在复杂多变的食品和饮料基质中可靠检测OTA。

准确测定OTA需要在仪器分析之前进行高效且高选择性的样品前处理。尽管HPLC-FLD或HPLC-MS等色谱技术灵敏度优异，但其整体性能高度依赖于提取和净化效率。传统吸附剂（如C18键合硅胶、聚合物相HLB等）通常存在选择性有限、基质干扰显著和富集因子低等问题。金属有机框架（MOF）因其高比表面积、可调孔隙率和可修饰的表面化学性质，成为有前景的吸附剂，但原始MOF在复杂基质中的选择性仍受限。为此，将适配体（Apt）——能够折叠成特定三维结构并与靶标分子高亲和力、高特异性结合的单链寡核苷酸——引入MOF材料，形成Apt@MOF杂化材料，以实现高选择性识别。已有研究将Apt@MOF与磁性核或电纺纳米纤维等载体集成，虽提升了选择性，但仍主要依赖颗粒或悬浮体系，需多步操作，且缺乏结构定义。将Apt@MOF集成到自支撑且结构明确的3D打印装置中，可将分散的吸附剂粉末转化为固态、易操作的提取单元，有望简化操作、防止材料损失、提高重现性并改善传质。

**2. 研究内容与结论**

本研究提出了一种将Apt@MOF杂化吸附剂集成到自支撑3D打印提取平台中的新策略，用于从酒精饮料中选择性提取OTA。研究人员首先在dSPE条件下评估了四种MOF（ZIF-8、UiO-66、UiO-66-vinyl和UiO-66-(COOH)₂），发现UiO-66-(COOH)₂对OTA的非特异性保留最低，这归因于其额外羧酸基团带来的更高亲水性。随后通过物理吸附将OTA特异性适配体固定在UiO-66-(COOH)₂上，所得杂化材料Apt-A@MOF对OTA的保留率达91%。将Apt-A@MOF通过PVDF涂层固定到3D打印聚丙烯装置上，装载时间优化为45 min后，OTA保留率提升至93.6%。研究人员对提取条件（pH、时间、温度、洗脱溶剂等）进行了系统优化，最终采用pH 3.0的装载溶液、45 min提取时间、25℃装载温度，以及含1%乙酸的ACN:H₂O (50:50, v/v)在35℃下洗脱45 min的条件。在最优条件下，方法回收率为91–95%，RSD ≤ 5.5%，检测限为0.06 μg L^-1，富集因子为4。选择性研究表明，该装置对OTA表现出高识别能力，对结构类似的OTB也有一定保留（77%），但对黄曲霉毒素、玉米赤霉烯酮和桔霉素等保留较低。该方法在红葡萄酒、琥珀啤酒和拉格啤酒加标样品中成功应用，获得了令人满意的回收率和有效的基质净化效果。该3D打印装置成本仅约0.49欧元/件，适合作为一次性提取平台，为食品安全分析提供了低成本、可定制的新型样品前处理工具。该研究发表于《Talanta》。

**3. 主要关键技术方法**

该研究采用的主要技术方法包括：（1）溶剂热/室温搅拌法合成四种MOF材料（ZIF-8、UiO-66、UiO-66-vinyl和UiO-66-(COOH)₂），并通过XRD确认晶体结构；（2）通过物理吸附策略制备Apt@MOF杂化材料，利用Cy5标记适配体荧光法定量评估固定化效率（99.94%）和负载量（199.83 pmol mg^-1）；（3）采用熔融沉积建模（FDM）3D打印技术，使用商业聚丙烯（PP）丝材制备三部件互锁结构的提取装置；（4）PVDF基涂层策略将Apt-A@MOF固定到3D打印装置表面；（5）通过SEM-EDS、XPS、XRD和FTIR对功能化装置进行表征；（6）HPLC-FLD进行OTA定量分析。商业酒精饮料样品（红葡萄酒、琥珀啤酒、拉格啤酒）购自当地超市。

**4. 研究结果**

**4.1 MOF筛选、Apt@MOF制备及dSPE条件优化**

研究人员比较了四种MOF对OTA的保留能力，确认UiO-66-(COOH)₂在pH 3.0下表现出最低的非特异性保留（<15%），这归因于其羧基官能团增强的表面亲水性。对比共价固定化（Apt-C@MOF）和物理吸附（Apt-A@MOF）两种适配体固定化策略，两者均实现了>90%的OTA保留率，但物理吸附策略操作更简便且无需偶联试剂，故被选用于后续实验。通过Cy5荧光标记适配体实验确定固定化效率为99.94%，负载量为199.83 pmol mg^-1，且洗涤过程中适配体释放可忽略不计。装载pH优化实验表明，pH 3.0时裸MOF对OTA的保留最低，而Apt-A@MOF在所有测试pH（1.5–7.0）下均保持88–97%的高保留率，证实了适配体识别的主导作用。最佳提取时间为30 min，装载温度为25℃。洗脱条件优化发现，含1%乙酸的ACN:H₂O (50:50, v/v)在35℃下洗脱45 min可获得约100%的回收率。

**4.2 Apt@MOF涂层3D打印装置的制备与表征**

溶剂相容性测试表明，PP基3D打印基底在测试溶剂中均表现出优异稳定性。对比壳聚糖和PVDF两种涂层策略，PVDF涂层在装载和洗脱条件下均无脱落现象，故被选用。20个装置的批次制备实验显示，每个装置的Apt-A@MOF平均负载量为6.6 ± 0.3 mg，具有良好的批间可重复性。SEM表征显示，裸PP表面光滑，PVDF涂层后呈现半结晶形态，Apt-A@MOF固定后可见大量球形MOF聚集体。EDAX元素分析检测到Zr（1.75%）和P（0.15%），分别证实了MOF和适配体的存在。XPS分析进一步确认了PVDF涂层（F 1s信号）及Apt-A@MOF的成功固定（Zr 3d、N 1s和P 2p信号）。XRD图谱中出现了UiO-66-(COOH)₂的特征衍射峰，FTIR光谱也观察到了MOF的羧基和配位羧酸根特征吸收带。所有表征结果共同证实了Apt-A@MOF-PVDF涂层在3D打印PP表面的成功制备。

**4.3 采用Apt-A@MOF-PVDF涂层3D打印装置提取OTA**

在dSPE优化条件的基础上，研究人员将提取时间从30 min延长至45 min后，3D打印装置对OTA的保留率从84%提升至93.6 ± 1.9%，与粉末形式的Apt-A@MOF相当（91.9%）。裸PP和PVDF涂层装置对OTA的保留可忽略不计（<4%），MOF-PVDF涂层装置保留率低于15%，证实了适配体在选择性提取中的主导作用。洗脱实验获得了94 ± 4%的回收率。富集因子优化方面，采用2 mL装载体积和0.5 mL洗脱体积获得了最高PF（4），同时不降低提取效率。装置的重复使用性研究表明，第三个提取-洗脱循环后OTA保留率明显下降，通过Cy5标记适配体稳定性实验确认这是由洗脱过程中适配体逐渐释放所致，因此装置更适合作为一次性使用格式。

**4.4 Apt-A@MOF-PVDF涂层3D打印装置的选择性**

选择性研究表明，Apt-A@MOF-PVDF涂层装置对OTA表现出最高的保留率（93.6%），对结构类似的OTB也有77%的保留，但对黄曲霉毒素B1（AFB1）、B2（AFB2）、G1（AFG1）的保留均低于14%。对于玉米赤霉烯酮（ZEA）和桔霉素，Apt功能化未显著增强其保留，说明这些毒素的保留主要受MOF的非特异性相互作用控制。基质干扰实验表明，葡萄糖、果糖、蔗糖及苹果酸、没食子酸和酒石酸对OTA提取的影响有限，装置对这些常见基质成分具有良好耐受性。

**4.5 分析性能**

在优化条件下，方法在1–100 μg L^-1浓度范围内呈现良好线性（r > 0.999）。结合4倍的富集因子，方法LOD和LOQ分别为0.06 μg L^-1和0.20 μg L^-1。批内和批间RSD分别为3.3%和5.5%，表明装置制备和提取过程具有良好的重现性。装置在室温干燥条件下储存一个月后，提取性能无显著变化，表现出良好的储存稳定性。

**4.6 实际食品样品中OTA的测定**

研究人员将开发的装置应用于红葡萄酒和啤酒样品中OTA的测定。未经加标的商业样品中OTA浓度均低于LOD，故进行了0.5和2 μg/kg两个水平的加标回收实验。所有样品的回收率在91–95%之间，且提取后色谱图中基质干扰峰显著减少，证实了该装置在实际复杂基质中具有高效的净化能力和可靠的定量性能。

**4.7 与其他已发表方法的比较**

与已报道的基于MOF、适配体功能化吸附剂及Apt@MOF杂化材料的OTA提取方法相比，现有方法多采用磁分散或分散SPE形式，需要分散、磁分离或离心等额外步骤。本研究开发的装置将Apt@MOF集成到自支撑3D打印平台上，消除了吸附剂回收和操作步骤，同时保持了适配体识别提供的选择性，回收率（91–95%）和LOD（0.06 μg L^-1）与已有方法相当，且成本低廉、适合一次性使用。

**5. 结论讨论与总结**

本研究成功开发了一种基于Apt@MOF杂化材料固定在3D打印平台上的选择性提取装置，用于酒精饮料中OTA的测定。UiO-66-(COOH)₂因其低非特异性吸附被选为载体，使分析物识别主要由适配体控制，确保了高选择性。适配体通过物理吸附固定在MOF上，操作简便且保持了高OTA识别性能。采用PVDF涂层策略将Apt@MOF整合到PP 3D打印装置上，获得了机械稳定且可重现的提取平台。该装置提供了高OTA保留、定量洗脱和有效富集，同时避免了分散吸附剂系统的常见限制。制造过程简单且成本效益高（约0.49欧元/装置），适合作为一次性提取格式。

研究结论表明，该方法在加标葡萄酒和啤酒样品中获得了令人满意的回收率和有效的样品净化，但存在一些局限性：装置对结构相关的OTB也有一定保留，MOF涂层存在一定的非特异性相互作用，且三次提取-洗脱循环后性能下降，更适合一次性使用。此外，该方法的验证基于加标样品，未来针对天然污染样品和标准参考物质的研究将进一步完善验证。总体而言，这项工作展示了将Apt@MOFs集成到自支撑3D打印提取装置中的潜力，将颗粒吸附剂转化为功能化且易操作的提取平台，为食品安全分析中开发选择性、低成本和可定制的样品前处理工具开辟了新途径。