食源性致病 弧菌属 物种是与海鲜消费和海洋环境相关的主要细菌危害，给全球公共健康和食品安全带来了持续挑战 (Brauge et al., 2024)。在这些微生物中，副溶血性弧菌、创伤弧菌、霍乱弧菌 和 溶藻弧菌 被公认为最普遍且具有临床意义的物种。这些病原体常被归因于海鲜相关的胃肠炎、伤口感染、败血症和大规模爆发事件。它们在沿海地区以及海水温度较高时期的发生频率尤为升高 (Baker-Austin et al., 2018; Loo et al., 2022)。由于这些细菌占据相似的生态栖息地并拥有相似的传播途径，多种 弧菌属 物种同时污染海鲜产品的情况经常被观察到。这种共现进一步增加了食品安全监测和风险评估的复杂性 (Brumfield et al., 2023; López-Pérez et al., 2021)。因此，建立多重化、快速的检测方法，能够同时现场识别多种致病性 弧菌属 物种，对于及时监测和预防海鲜污染爆发具有重要价值。
目前，食源性细菌病原体的定性识别主要依赖于传统的基于培养分离的方法，随后进行生化鉴定，这继续作为参考诊断方法。然而，这些程序本质上耗时且需要大量劳动力。此外，它们对配备完善的实验室基础设施的强烈依赖限制了其在快速现场监测和实时决策中的应用 (Foddai et al., 2020; Shen et al., 2021)。为了克服这些限制，基于分子生物学和生物传感技术的多种多重快速检测策略已被越来越多地开发。
这些方法主要包括三类。首先，基于 PCR 的分子检测，如多重定量实时 PCR (qPCR) 和液滴数字 PCR，提供了高灵敏度和特异性。然而，它们需要精密的仪器和严格控制实验室环境，这限制了其在现场应用中的直接使用 (Cui et al., 2024; Jia et al., 2025; Kim et al., 2025)。其次，基于生物传感器和纳米材料的检测方法采用金纳米颗粒和磁性纳米颗粒等材料进行信号转导和放大，这显著提高了分析灵敏度。这些策略已成功应用于检测 副溶血性弧菌 (Wang et al., 2020)、鼠伤寒沙门氏菌 (Kumar et al., 2025)、单核细胞增生李斯特氏菌 (Du et al., 2022) 和 大肠杆菌 O157:H7 (Wang, Li et al., 2023)。然而，这些方法通常需要集成系统用于多靶标检测，并且可能涉及相对较高的成本。第三，人们广泛关注在等温条件下进行的核酸扩增方法，特别是那些与基于 CRISPR 的检测平台集成的方法。这些方法中值得注意的是环介导等温扩增 (LAMP) (Li et al., 2025; Safenkova et al., 2026; Wang et al., 2025) 和 RPA-CRISPR (Fu et al., 2025; Luo et al., 2026; Zhong et al., 2025)。这些方法能够在恒温条件下实现快速核酸扩增和高特异性靶标识别，大大缩短了检测时间，并显示出在现场应用中的巨大潜力。
近年来，微流控技术作为一种有效平台涌现，用于整合和自动化这些检测策略。通过精确控制微尺度通道内的流体，微流控系统允许微型化、自动化和并行反应。这种设计减少了试剂消耗并最大限度地减少了交叉污染，同时提高了通量和系统集成度。此外，几项近期研究将 RPA-CRISPR 检测模块整合到多通道微流控平台中，从而实现了对多种病原微生物的快速、灵敏和同时识别 (Chen, Lu et al., 2025; Fang et al., 2026; Han et al., 2025; Xu et al., 2025)。尽管基于 CRISPR/Cas 的分子诊断在快速和分散式测试方面显示出巨大潜力，但在实际现场应用中实现可靠的多重检测仍然具有挑战性 (Zhang et al., 2025; Ansari, et al., 2026; Chen et al., 2026)。当前的多重 CRISPR 平台通常需要复杂的信号编码方案、多种反应配置或外部复杂的分析设备，这可能会损害操作的简便性并限制其在资源有限环境中的部署。特别是，同时识别多种密切相关的食源性 弧菌属 物种需要一个集成高特异性、多重能力、便携性和操作简便性的检测系统。因此，开发一种紧凑、高效且用户友好的微流控辅助多重 CRISPR 平台，用于多种 弧菌 病原体的快速现场筛查仍然非常令人期待。
在本研究中，开发了一种基于离心微流控芯片的多重 RPA-CRISPR/Cas12a 定性检测平台，靶向上述四种主要食源性致病 弧菌属 物种。在经过快速简化的样品制备后，提取的 DNA 被直接加载到芯片上，并通过离心力自动分配到独立的反应室中。每个反应室含有针对特定 弧菌 物种靶基因的冻干 RPA-CRISPR 试剂，使得能够在单次测定中同时检测四种病原体。在本平台中，完整的检测工作流程可以在恒温条件下于 60 分钟内完成，结果可以通过基于荧光的视觉读出直接解释。该系统在真实性海鲜样品测试中经过了彻底验证其实际适用性、灵敏度和特异性。该方法为海鲜产品和 aquatic habitats 中多种物种 弧菌 污染的快速现场筛查和风险评估提供了一种高效且切实的策略。图 1 提供了检测平台工作流程的详细示意图。图 S1 说明了从样品制备到最终信号输出的相应实际检测程序。
