下加利福尼亚和加利福尼亚湾岛屿响尾蛇的功能性毒液活性与抗蛇毒血清中和作用

《Toxicon》：Functional venom activity and antivenom neutralization in rattlesnakes across Baja California and Gulf of California islands

　　

摘要
蛇毒是复杂的生化表型，其组成在不同类群间可能存在巨大差异，然而对于许多谱系而言，这种变异的功能和生物医学后果仍研究不足。在此，我们表征了分布于下加利福尼亚半岛和加利福尼亚湾岛屿及大陆地点的多个响尾蛇物种毒液的功能活性。我们定量分析了 55 个个体（涵盖 Crotalus enyo、C. mitchellii、C. pyrrhus sensu lato 和 C. ruber）的磷脂酶 A2 (PLA2)、蛋白酶解和纤维蛋白原降解活性以及半数致死量 (LD50)。我们还评估了商品化多价抗蛇毒血清 Antivipmyn? 的中和效力。毒液功能活性在不同物种间存在显著差异。Crotalus mitchellii 表现出神经毒表型，其特征在于最高的 PLA2 活性、最低的 LD50 值和最小的蛋白酶解活性。Crotalus pyrrhus 和 C. ruber 表现出蛋白酶解表型，具有高酶活性和普遍的双链纤维蛋白原降解。Crotalus enyo 表现出中等功能活性，具有适度的酶产出和物种间最有效的抗蛇毒血清中和能力。尽管 Antivipmyn? 中和了所有毒液的致死活性，但在质量标准化 (mgAV/mgV) 和效价缩放 (每瓶 LD50 当量) 指标下，效力在不同物种间存在显著差异。值得注意的是，种内的岛屿种群和大陆种群在功能活性和抗蛇毒血清反应方面均表现出定性变异。这些结果确立了目标物种具有功能上截然不同的毒液表型，并对抗蛇毒血清中和具有物种特异性后果，强调了毒液功能表征对下加利福尼亚地区咬伤临床管理的相关性。

引言
蛇毒是由 40–100 种蛋白质和多肽组成的复杂生化表型，共同介导猎物固定、消化和防御 (Daltry et al., 1996, Barlow et al., 2009, Casewell et al., 2011, Munawar et al., 2018, Mackessy, 2021)。毒液组成通常在物种间 (Glenn and Straight, 1985, Casewell et al., 2014, Margres et al., 2015b, Jackson and Fry, 2016, Jackson et al., 2016, Durban et al., 2017, Pla et al., 2019, Senji Laxme et al., 2019, Holding et al., 2021, Borja et al., 2025, Hirst et al., 2025)、种群间 (Massey et al., 2012, Margres et al., 2015b, Holding et al., 2018, Margres et al., 2019, Smith et al., 2023, Hirst et al., 2024, Hirst et al., 2025) 以及个体发生过程中的个体间 (Andrade and Abe, 1999, Alape-Girón et al., 2008, Barlow et al., 2009, Margres et al., 2015b, Margres et al., 2015a, Wray et al., 2015, Modahl et al., 2016, Durban et al., 2017, Rokyta et al., 2017, Cipriani et al., 2017, Borja et al., 2018, Schonour et al., 2020, Hirst et al., 2024, Borja et al., 2025) 广泛变异。尽管这种组成多样性已有充分记录，但毒液变异的功能后果往往较少被探索。因为蛇毒主要是一种营养适应，其功能特性由猎物的生理特征塑造 (Daltry et al., 1996, Barlow et al., 2009, Holding et al., 2016, Smiley-Walters et al., 2017, Holding et al., 2021)。选择青睐能有效使具有特定生化和生理防御的猎物丧失行动能力的毒液表型；因此，饮食转变可以驱动态毒液组成和功能的分化 (Barlow et al., 2009, Holding et al., 2016, Margres et al., 2017b, Smiley-Walters et al., 2017, Casewell et al., 2020, Mackessy, 2021, Holding et al., 2026)。历史上，响尾蛇中最分化的毒液表型使用 A 型和 B 型二分法进行分类，区分高致死性、神经毒性 A 型毒液和以低致死性和高蛋白酶解活性为特征的 B 型毒液 (Glenn and Straight, 1978, Glenn et al., 1983)。该框架进一步细化为 I 型和 II 型分类系统，以描述金属蛋白酶活性与全身致死性之间的基本反比关系 (Mackessy, 2010)。在此模型下，I 型（大致对应于 B 型）毒液强调组织破坏性蛋白酶解，而 II 型（A 型）毒液优先考虑全身毒性。然而，这些类别代表功能连续体的两端，而非离散状态；中间表型（I+II 型）存在 (Mackessy, 2010, Strickland et al., 2018, Colis-Torres et al., 2022)，利用神经毒性和蛋白酶解策略。这种生化梯度直接影响咬伤的临床表现，因为这些毒素家族平衡的转变可以影响咬伤的病理生理学和抗蛇毒血清中和的效力 (Calvete, 2010, Casewell et al., 2014)。

最近的研究表明，来自下加利福尼亚半岛和邻近加利福尼亚湾岛屿的四种响尾蛇物种（下加利福尼亚响尾蛇 (Crotalus enyo)、红菱响尾蛇 (C. ruber)、斑点响尾蛇 (C. mitchellii) 和西南斑点响尾蛇 (C. pyrrhus sensu lato)）种群间的毒液蛋白质表达存在显著变异 (Hirst et al., 2024, Hirst et al., 2025, Hirst et al., 2026)。我们之前发现毒液表达在不同岛屿间存在显著差异，毒液复杂性由岛屿大小、隔离程度和竞争预测 (Hirst et al., 2025)。同样，我们记录了 C. ruber 大陆分布范围内的毒液地理变异 (Hirst et al., 2024) 以及 C. enyo 的岛屿和大陆种群之间的变异 (Hirst et al., 2026)。这些发现与下加利福尼亚更广泛的毒理学和流行病学调查 (Glenn and Straight, 1985, Rodríguez-Canseco et al., 2021) 一致，这些调查已确定许多同域分布的同一分类群在下加利福尼亚南部 (Arnaud-Franco et al., 2018) 以及特定谱系（如斑点响尾蛇复合群 (Arnaud-Franco et al., 2023) 和 C. ruber (Pozas-Ocampo et al., 2020)）中存在显著的生化分化。然而，我们尚未确定半岛和岛屿上毒液表达的大规模变异是否转化为毒液活性功能上的差异和/或抗蛇毒血清效力的差异。

毒液蛋白质可以在相对丰度上存在显著变异而不改变整体酶活性、毒性或生物学效应 (Casewell et al., 2013, Margres et al., 2016, Gutiérrez et al., 2017, Xiong and Huang, 2018, Pucca et al., 2020, Mackessy, 2021, Rudresha et al., 2025)。因此，不能假设表达谱的差异本身就反映功能分化或预测抗蛇毒血清性能。因此，确定地理变异的毒液是否在功能特性（如磷脂酶 A2 活性、蛋白酶解能力、纤维蛋白原降解和致死性）上存在差异，不仅对于理解毒液进化的生物后果至关重要，而且对于评估毒液变异对抗蛇毒血清效力的生物医学影响也至关重要。

在墨西哥，蝰蛇咬伤通常使用 Antivipmyn? 进行治疗，这是一种商业生产的多价抗蛇毒血清，由针对医学重要蝰蛇科毒液混合物（主要是 Bothrops asper 和 Crotalus durissus）生成 (Sánchez et al., 2003, Ponce-López et al., 2020, Guadarrama-Martí兹 et al., 2024)。多价抗蛇毒血清旨在跨分类群和地区提供广泛保护，但其效力可能根据目标毒液相对于生产所用毒液的生化组成和功能特性而异 (Ratanabanangkoon, 2003, Mukherjee et al., 2016, Ratanabanangkoon, 2023)。如果毒液功能在岛屿和大陆种群间存在显著差异，特别是驱动局部组织损伤或全身毒性的酶活性，这种变异可能会影响抗蛇毒血清的中和性能 (Vohra et al., 2008, Massey et al., 2012, Musick et al., 2024, Borja et al., 2025)。这个问题在下加利福尼亚尤为相关，该地区旅游水平高，且人类频繁访问大陆地点和近海岛屿，目标响尾蛇物种在此发生 (Grismer, 2002, Schmitz and Diaz, 2013, Olmos-Martínez et al., 2018)。

在本研究中，我们直接基于先前记录毒液组成地理变异的工作 (Glenn and Straight, 1985, Arnaud-Franco et al., 2018, Pozas-Ocampo et al., 2020, Arnaud-Franco et al., 2023, Hirst et al., 2024, Hirst et al., 2025, Hirst et al., 2026)，以评估该变异是否转化为毒液功能和抗蛇毒血清效力的差异。我们表征了跨岛屿和大陆地点采样的四种响尾蛇物种种群的毒液功能特性，重点关注磷脂酶 A2 活性、蛋白酶解活性、EDTA 不敏感蛋白酶解（即对金属蛋白酶抑制具有抗性的蛋白酶解活性部分）、致死性 (LD50) 和纤维蛋白原降解活性（评估时伴有和不伴有蛋白酶抑制剂）。然后，我们使用互补的质量基础和效价缩放指标评估了商品化多价抗蛇毒血清 Antivipmyn? 的中和性能。通过将毒液功能多样性与抗蛇毒血清中和能力联系起来，本研究在毒液变异模式与其生物和临床后果之间提供了桥梁。

章节片段
采样与生物伦理
毒液样本从四种响尾蛇物种的 55 个个体中收集，包括 Crotalus mitchellii (n = 10)、C. ruber (n = 14)、C. enyo (n = 17) 和 C. pyrrhus sensu lato (n = 14)。蛇类样本采集于沿下加利福尼亚半岛长度分布的 11 个岛屿和 6 个大陆地区 (图 1)。为了最大化物种比较的样本量，三个先前被描述为不同物种的 C. pyrrhus sensu lato 岛屿种群 (C. angelensis

毒液复杂性
毒液复杂性在不同物种间存在显著差异 (Kruskal–Wallis: H = 25.17, df = 3, P < 0.0001)。成对 Dunn 检验显示，C. enyo 的毒液复杂性显著高于 C. mitchellii (padj = 0.0015) 和 C. ruber (padj < 0.0001)，且 C. pyrrhus 的毒液复杂性显著高于 C. ruber (padj = 0.0064)；所有其他成对比较均不显著 (padj > 0.05; 补充表 S2)。Crotalus enyo 毒液表现出最高且最

讨论
跨越下加利福尼亚半岛和加利福尼亚湾岛屿采样的四种响尾蛇物种表现出功能上截然不同的毒液表型，跨越了 I 型–II 型连续体，从 C. mitchellii 的高度神经毒性谱系到 C. pyrrhus 和 C. ruber 的金属蛋白酶主导表型。这种功能多样性建立在先前记录的该系统组成变异基础之上 (Glenn and Straight, 1985, Arnaud-Franco et al., 2018, Rodríguez-Canseco et al., Holding et al., 2026)

CRediT 作者贡献声明
Samuel R. Hirst：写作 – 初稿，调查，资金获取，形式分析，数据管理，概念化。Edgar Neri-Castro：写作 – 初稿，监督，调查，资金获取，形式分析，数据管理，概念化。Emiliano Vázquez-García：调查。Vanessa Zarzosa：调查。Felipe Olvera：调查。Cameron M. VanHorn：调查。Alejandro Alagón：调查。Hector Franz-Chávez：调查。Gamaliel

伦理声明
采样在环境自然资源部 (SGPA/DGVS: 06166/20, 01178/20, 04856/21, 04999/22) 颁发的许可证下进行。所有程序遵循南佛罗里达大学 (方案 IS00011949) 和克莱姆森大学 (方案 2017-067) 机构动物护理和使用委员会 (IACUC) 批准的伦理指南。动物使用经墨西哥国立自治大学 (UNAM) 生物技术研究所生物伦理委员会批准，项目 #471。

资金支持
本工作由以下支持：美国国家科学基金会研究生奖学金计划授予 S.R.H 的资助号 2136515，国家地理学会 (NGS-91224R-21) 授予 M.J.M., J.L.S., M.B., G.C.-G., C.L.P. 和 H.F.-C.，美国自然历史博物馆西奥多·罗斯福纪念基金授予 M.J.M.，西部北美自然主义者自然历史研究拨款授予 S.R.H，以及美国国家科学基金会 (DEB 1638879 和 DEB 1822417) 授予

利益冲突声明
作者声明他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系，这些可能看起来影响本论文报告的工作。

致谢
我们想感谢 Víctor Vásquez-Cruz, Alfonso Kelly-Hernández, Alexandra Rubio Rincón, Tania Perez Fiol, David Emaús López Martínez, Sofía Alejandra Salinas Amézquita, Ramsés Alejandro Rosales-García, Chris Grünwald, Chris Rodriguez, Brandon La Forest, Jacobo Reyes-Valasquez, Brandon Deitrich 和 Jacob Loyacano 对采样的帮助。我们感谢 CONANP 和埃斯皮里图桑托群岛国家公园的 Luz Aurora Hurtado, Irma Gonzalez 和 Raol Preciado，Jesus Oswaldo

Samuel R. Hirst|Edgar Neri-Castro|Emiliano Vázquez-García|Vanessa Zarzosa|Felipe Olvera|Cameron M. VanHorn|Alejandro Alagón|Hector Franz-Chávez|Gamaliel Casta?eda-Gaytán|Christopher L. Parkinson|Jason L. Strickland|Miguel Borja|Mark J. Margres
南佛罗里达大学，整合生物学系，12037 USF Beard Drive, Tampa, 33620, FL, 美国