《Veterinary Parasitology》：Feline leishmaniosis: new insights into serological and molecular detection of
Leishmania spp.
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猫利什曼病（FeL）的诊断仍缺乏标准化的血清学检测方法。间接荧光抗体试验（IFAT）表现出较高的敏感性，而双平台快速检测（DPP?）则显示出较高的特异性。基于动基体DNA（kDNA）的聚合酶链式反应（kDNA-PCR）能够利用结膜拭子实现
猫利什曼病（FeL）的诊断仍缺乏标准化的血清学检测方法。间接荧光抗体试验（IFAT）表现出较高的敏感性，而双平台快速检测（DPP?）则显示出较高的特异性。基于动基体DNA（kDNA）的聚合酶链式反应（kDNA-PCR）能够利用结膜拭子实现可靠的寄生虫检测。结膜拭子是一种前景广阔的非侵入性样本，可用于猫利什曼病的诊断。上述发现有助于改进猫利什曼病的诊断策略。
**猫利什曼病诊断研究解读：血清学与分子检测方法的综合评估**
**一、研究背景与意义**
利什曼病是由利什曼原虫属（*Leishmania* spp.）锥虫科原生动物引起的人兽共患寄生虫病，通过雌性白蛉叮咬传播。在巴西等流行地区，婴儿利什曼原虫（*Leishmania infantum*）是引起人兽共患内脏利什曼病（VL）的主要病原体，犬类长期被视为城市传播循环中的主要贮主宿主。历史上，猫曾被认为是利什曼原虫感染的抗性宿主，但近年来越来越多的证据表明，猫在流行地区感染利什曼原虫的现象并不罕见。已有实验研究通过异体接种试验证明，感染婴儿利什曼原虫的猫能够将寄生虫传播给白蛉媒介，提示猫可能作为次要贮主宿主参与传播循环。然而，猫利什曼病（FeL）的诊断仍面临诸多挑战：目前应用于猫的诊断方法和样本类型多直接沿用犬类标准，忽视了两个物种间内在的遗传和免疫学差异；尚无专门针对猫的即时检测（point-of-care）试剂盒获得验证；侵入性样本（如骨髓、淋巴结穿刺）采集在猫科动物中存在操作困难和动物福利问题。因此，开展针对猫科动物样本的血清学和分子诊断方法的系统评估，验证非侵入性采样方案的可行性，对提高猫利什曼病诊断准确性、完善流行病学监测策略具有重要的科学意义和临床应用价值。
**二、研究方法与技术路线**
该研究经巴西圣保罗大学兽医学与动物科学学院动物使用伦理委员会批准（CEUA编号3314060320），在巴西圣保罗州多个城市通过便利抽样法纳入51只家猫（*Felis catus*），样本来源包括收容所动物、流浪猫种群控制项目捕获的猫以及宠物猫。研究采用的综合诊断体系涵盖以下关键技术平台：（1）寄生虫学诊断：采集淋巴结、骨髓穿刺涂片进行吉姆萨染色细胞学检查，皮肤组织活检标本进行组织病理学检查，同时将血液、淋巴结、骨髓、皮肤和病变样本接种于Schneider's果蝇培养基进行体外寄生虫分离培养；（2）血清学检测：采用针对婴儿利什曼原虫的双平台快速检测（DPP
?，Bio-Manguinhos/FIOCRUZ）和间接荧光抗体试验（IFAT），其中IFAT分别采用1:40和1:80两种临界滴度进行评估，同时检测抗弓形虫（*Toxoplasma gondii*）抗体以评估交叉反应；（3）分子诊断：从血液（BL）、结膜拭子（CS）、口腔拭子（OS）、淋巴结（LN）、骨髓（BM）和皮肤（SK）样本中提取DNA，扩增利什曼原虫动基体DNA（kDNA）和锥虫科核糖体DNA内转录间隔区1（ITS1）两个分子靶标，阳性扩增产物经Sanger双末端测序后进行BLAST比对和系统发育分析；（4）数据统计：以寄生虫学确认（细胞学和/或组织学和/或培养分离）结合相符临床症状作为复合参考标准，计算各检测方法的敏感性、特异性和准确性，并采用Cohen's kappa系数评估两种PCR方法的一致性，Spearman秩相关分析诊断结果与临床表现、猫免疫缺陷病毒（FIV）/猫白血病病毒（FeLV）感染状态及弓形虫抗体阳性率之间的关联。
**三、研究结果**
**1. 寄生虫学检测与寄生虫分离鉴定**
细胞学和/或组织学检查在4只猫（7.8%）中检出利什曼原虫无鞭毛体，同一4只猫的临床样本在体外培养中均成功分离出寄生虫。培养分离寄生虫的ITS2-PCR测序证实其中3只猫为婴儿利什曼原虫感染（MFEL/BR/2019/LI1、MFEL/BR/2022/LI2和MFEL/BR/2022/LI3；GenBank
?登录号PX758235–PX758237），另发现1只猫存在婴儿利什曼原虫与*Crithidia fasciculata*混合感染（MFEL/BR/2018/CF1；GenBank
?登录号PX756503）。
**2. 血清学检测性能评估**
采用1:40临界值的IFAT在63%的猫中检出抗婴儿利什曼原虫抗体，敏感性为100%（95% CI: 40%–100%），特异性仅为40%（95% CI: 26%–57%），抗体滴度范围为40至5,120。将临界值提高至1:80后，血清阳性率降至43.8%，在保持100%敏感性（95% CI: 40%–100%）的同时，特异性提升至62%（95% CI: 46%–76%）。相比之下，DPP
?快速检测仅检出10.6%的阳性猫，敏感性为75%（95% CI: 19%–99%），特异性高达95%（95% CI: 84%–99%）。
**3. 分子检测性能评估**
kDNA-PCR在5只猫（9.8%）的生物学样本中扩增出利什曼原虫kDNA，所有kDNA-PCR阳性猫均被ITS1-PCR检出，Sanger测序证实这些猫样本中存在婴儿利什曼原虫核糖体DNA。此外，ITS1-PCR额外检出一只感染亚马逊利什曼原虫（*L. amazonensis*）的猫。全部7条序列已提交GenBank
?（登录号PQ454611–PQ454618）。在诊断性能方面，kDNA-PCR在所有组织样本中显示100%（95% CI: 40%–100%）的敏感性和98%（95% CI: 89%–100%）的特异性；按样本类型分层分析显示，LN、BM、SK和BL样本间无显著差异。非侵入性样本中，结膜拭子（CS）的kDNA-PCR敏感性为100%（95% CI: 40%–100%），特异性略降至98%（95% CI: 88%–100%）；而口腔拭子（OS）表现较差，敏感性为75%（95% CI: 19%–99%），特异性为100%（95% CI: 91%–100%）。ITS1-PCR的整体特异性（96%；95% CI: 85%–99%）略低于kDNA-PCR，在CS样本中敏感性和特异性分别降至75%和96%，在OS样本中敏感性最差（0%；95% CI: 0%–60%）。两种PCR方法的一致性分析显示，总体Kappa系数为0.898（几乎完全一致），BM、LN、SK和BL样本的一致性系数为1，CS样本为0.778（高度一致），而OS样本的一致性系数为0（极差）。
**4. 临床病理学关联分析**
体格检查中皮肤病变最为常见（42%），主要包括脱毛性、溃疡性和结节性病变，其次为外周淋巴结肿大（34%）、眼部病变（22%）、耳炎（18%）、黏膜苍白（16%）、口腔病变（14%）和恶病质（10%）。统计学分析显示，皮肤病变与寄生虫学阳性显著相关；恶病质与寄生虫学和分子诊断结果均呈正相关。1:40 IFAT阳性与皮肤病变、口腔病变、耳炎、白细胞增多、ALT升高、高蛋白血症和高球蛋白血症呈正相关；1:80 IFAT阳性除上述关联外，还与眼部病变和单核细胞增多症相关。值得注意的是，1:40 IFAT和1:80 IFAT阳性均与弓形虫抗体阳性显著相关，但未观察到FIV/FeLV感染与利什曼原虫诊断结果之间存在显著关联。
**5. 系统发育分析**
基于ITS1序列的最大似然（ML）系统发育分析显示，本研究获得的婴儿利什曼原虫序列与来自巴西猫（MN245031.1）、以色列猫（ON036077.1）、意大利白蛉（MG969403.1）和墨西哥白蛉（MN503527.1）的同种序列聚为一支；亚马逊利什曼原虫序列与来自特立尼达和多巴哥猫（OP876785.1）及巴西人源（DQ182536.1）的序列聚类，以*Crithidia fasciculata*（HM004585）作为外群。
**四、讨论与结论**
本研究系统评估了猫利什曼病多种诊断方法的性能。寄生虫学检测虽为确诊金标准，但敏感性较低，阴性结果不能排除感染。IFAT在1:40临界值时敏感性高但特异性不足，可能反映既往暴露而非活动性感染，且粗抗原制备增加了与其他锥虫科原虫的交叉反应风险；提高临界值至1:80可在不影响敏感性的前提下改善特异性。DPP
?虽为犬用试剂在猫中的超说明书应用，但显示出良好的特异性，可作为辅助筛查工具。分子检测方面，kDNA-PCR和ITS1-PCR均能检出所有经参考标准确认的感染猫，其中kDNA的高拷贝数（约10,000拷贝）赋予其优异的扩增敏感性。结膜拭子作为非侵入性样本展示了良好的诊断性能，支持其作为临床和流行病学研究中实用采样方案的可行性。研究还发现了一只婴儿利什曼原虫与*Crithidia fasciculata*混合感染的猫，以及一只无临床症状的亚马逊利什曼原虫感染猫，丰富了猫利什曼原虫感染的流行病学认识。研究结论指出，婴儿利什曼原虫正在巴西流行地区的家猫中传播，感染可伴随非特异性临床表现和血液学、生化异常；分子检测方法（特别是kDNA-PCR）具有高诊断准确性，血液和结膜拭子是前景广阔的微创检测样本，适用于临床调查和流行地区的流行病学研究。
