铁重链通过TGF-β1信号通路介导尼罗罗非鱼抗菌免疫

《Water Biology and Security》：Ferritin heavy chain mediates antibacterial immunity via TGF-β1 signaling in Oreochromis niloticus

　　

研究人员鉴定了尼罗罗非鱼（Oreochromis niloticus）铁蛋白重链（ferritin heavy chain，Fth）与中链（ferritin medium chain，Ftm），其中重组OnFth对无乳链球菌（Streptococcus agalactiae）和嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）表现出直接抑菌活性，而OnFtm无此功能。体内外实验表明，病原感染显著诱导OnFth在肝、脾、头肾、肠等免疫相关组织中表达上调；siRNA敲低OnFth后，肝与脾内亚铁离子（Fe2+）及总铁离子蓄积，转铁蛋白（transferrin，TF）、转铁蛋白受体1（transferrin receptor 1，TFR1）、铁调素（hepcidin，Hepc）及 ferroportin（FPN）等铁稳态分子表达下调，肠道菌群α多样性（ACE、Shannon指数）与结构（基于Bray-Curtis距离的PCoA）紊乱，致病菌载量增加，罗非鱼死亡率升高。机制上，OnFth缺失抑制TGF-β1信号通路，表现为TGF-β1、TGF-β受体1/2（TGF-βR1/R2）转录与蛋白水平下降，Smad2/3磷酸化减弱；回补重组OnFth或使用TGF-β受体激酶抑制剂SB-431542干预证实，OnFth经促进TGF-β1通路活化发挥抗炎、抑菌与组织保护功能。跨物种比对显示Fth在硬骨鱼中高度保守，斑马鱼DrFth重组蛋白同样提升细菌感染存活率。该研究揭示OnFth除储铁外，作为抗菌肽样分子与免疫调节因子，通过调控铁稳态与TGF-β1信号参与罗非鱼先天免疫防御。

研究背景与立项依据

铁作为机体必需微量元素参与血红蛋白合成、DNA修复、氧化磷酸化及宿主防御等生理过程，铁代谢失衡既会促进自由基生成与病原增殖，也可导致缺铁性贫血与代谢障碍。铁蛋白（ferritin）是由24个亚基构成的空心笼状储铁蛋白，哺乳动物含重链（Fth，催化Fe²⁺氧化为Fe³⁺）与轻链（Ftl，促铁储存），而硬骨鱼仅报道重链（Fth）与中链（Ftm），无Ftl。已有研究在斑点叉尾鮰、大菱鲆、半滑舌鳎等鱼类中表征了ferritin序列与应激表达，但尼罗罗非鱼作为全球淡水养殖主导种，其OnFth/OnFtm的序列特征、抗细菌感染功能及炎症调控机制尚未见报道。集约化养殖中无乳链球菌与嗜水气单胞菌引发败血症、神经症状与溃疡，造成产业重大损失，因此阐明罗非鱼ferritin在感染免疫中的角色具有明确应用价值。研究人员以尼罗罗非鱼为模型，联合体外细胞、体内干扰与多组学手段，解析OnFth的抗菌、铁稳态与TGF-β1信号调控轴。

主要技术方法概述

研究人员所用样本队列包括广东广州育种场购入体重10±2 g（siRNA干扰）与100±5 g（原代细胞分离）尼罗罗非鱼，以及华南师范大学脑科学与健康研究所提供的斑马鱼。关键方法涵盖：基于qRT-PCR与Western blot的组织表达谱与感染诱导验证；原核可溶性表达纯化重组OnFth/OnFtm/DrFth并以微量稀释法与牛津杯法行体外抑菌、以攻毒回补实验行体内存活与肝载菌评估；原代头肾巨噬细胞与肝细胞经灭活菌刺激检测细胞因子；T7 RNAi系统合成siOnFth肌注敲低并行存活、铁离子试剂盒定量、16S rDNA测序分析肠道菌群β/α多样性；肝组织RNA-seq（Illumina NovaSeq 6000，DESeq2筛|log₂FC|≥1且Padj<0.05的DEGs）行GO/KEGG富集；SB-431542体内抑制TGF-β受体验证通路依赖；最后以斑马鱼DrFth回补实验证Fth功能保守性。

研究结果

3.1 OnFth与OnFtm序列特征及表达模式

克隆获得OnFth（ORF 534 bp/177 aa）与OnFtm（ORF 525 bp/174 aa），OnFth与慈鲷、青鳉、鲤、鲑同源性90.40%–98.87%。qRT-PCR显示OnFth在肝、脾高表达，OnFtm在外周血高表达，提示免疫相关分布。

3.2 OnFth抑制细菌增殖

重组OnFth（50 μg/mL）在OD₆₀₀动态监测与牛津杯实验中显著抑制S. agalactiae与A. hydrophila，Trx阴性对照无作用，OnFtm无抑菌圈。体内1×10⁷ CFU/mL攻毒下，OnFth回补组8天存活率较对照组提升25%（无乳链球菌组30%→55%）与25%（嗜水气单胞菌组20%→45%），肝匀浆涂板菌落数显著降低。

3.3 先天免疫中OnFth诱导表达

S. agalactiae与A. hydrophila腹腔攻毒24 h后，头肾、脾、肝、肠中OnFth mRNA及蛋白均显著上调，证实其为感染应答分子。

3.4 OnFth参与炎症调控

H&E显示攻毒组肝、脾、肠见细胞水肿、炎性浸润、绒毛损伤，OnFth回补减轻病理评分。qRT-PCR示组织内IL-1β、IL-6下调，IL-10上调；原代肝细胞与巨噬细胞中OnFth降低IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α，提升IL-10与TGF-β转录。

3.5 OnFth是罗非鱼抗菌免疫关键环节

siOnFth肌注24 h后肝、脾OnFth mRNA/蛋白敲低，肝Fe²⁺与总铁升高；攻毒后肝脾载菌量升高、8天死亡率增加，证明稳态表达不可或缺。

3.6 OnFth维持肠道菌群结构丰度

siOnFth组基于Bray-Curtis的PCoA与siGFP分离（PC1 73.61%），ACE与Shannon指数下降，Fusobacteriaceae科与Cetobacterium属占比锐减，表明OnFth通过铁代谢间接塑造菌群。

3.7 TGF-β1信号通路参与OnFth抗菌免疫

肝RNA-seq的DEGs经GO富集指向铁离子稳态、TGF-β通路；qRT-PCR验证TF、TFR1、Hepc、FPN下调。siOnFth组中TGF-β1、TGF-βR1、TGF-βR2 mRNA/蛋白及p-Smad2/3下降，回补OnFth逆转；SB-431542注射后即便加OnFth，TGF-βR1/2与p-Smad2/3仍受抑，确认OnFth经TGF-β1→Smad2/3轴发挥功能。

3.8 Fth跨物种保护功能

系统树显示OnFth聚于硬骨鱼Fth支；DrFth与OnFth三维结构相似（同源性75.14%），重组DrFth提升斑马鱼嗜水气单胞菌感染存活率，提示Fth抗菌保护在硬骨鱼保守。

讨论浓缩

研究人员在讨论中指出，ferritin超越储铁功能，作为急性期蛋白与抗菌肽样分子，在鱼类感染中被诱导并直接抑菌；OnFth通过螯合游离Fe²⁺限制病原获铁、下调促炎因子、激活TGF-β1通路协同抗炎修复，且Fth缺失引起铁转运分子Hepc/TF/TFR下调、肠道菌群α多样性收缩，构成“铁限制—TGF-β1活化—炎症稳态”调控轴。Fth氨基酸序列跨物种高保守性与其功能保守一致，为将ferritin作为感染/炎症诊断标志物与靶向调控节点提供依据。

结论翻译

综上，铁蛋白除作为细胞内主要储铁蛋白外，在免疫防御中具关键作用。研究人员证实尼罗罗非鱼OnFth与OnFtm在病原攻毒后显著上调，OnFth抑制细菌增殖、调控炎症、维持免疫组织与肠道菌群稳态，从而增强抗感染能力与存活率。进一步研究表明OnFth激活TGF-β1信号通路并增强Smad2/3磷酸化，形成正反馈强化抗菌免疫应答。多序列比对与三维结构分析显示Fth在小鼠、尼罗罗非鱼与斑马鱼间高度保守，提示ferritin同源蛋白在物种演化中行使保守的免疫保护功能。该论文发表于《Water Biology and Security》。