《Scientific Reports》：Bioreactor-based production of eumelanin nanoparticles by Streptomyces glaucescens NEAE-H: physicochemical characterization, anticancer and anti-inflammatory activities, and in silico analysis
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摘要
微生物真黑素纳米颗粒（EuM-NPs）作为一种具有良好生物相容性和生物可降解性的纳米材料，在生物医学应用中日益受到关注。本研究在7-L搅拌罐生物反应器中，于受控发酵条件下优化了灰色链霉菌（Streptomyces glaucescens）NEAE-H菌株
摘要
微生物真黑素纳米颗粒（EuM-NPs）作为一种具有良好生物相容性和生物可降解性的纳米材料，在生物医学应用中日益受到关注。本研究在7-L搅拌罐生物反应器中，于受控发酵条件下优化了灰色链霉菌（Streptomyces glaucescens）NEAE-H菌株生产EuM-NPs的工艺。研究考察了EuM-NPs的理化特性及其体内、体外和计算机模拟（in silico）的抗癌与抗炎活性。在搅拌速度为200 rpm、培养22小时后，EuM-NPs的最高产量达到367.51 μg/mL。理化表征揭示形成了近球形纳米颗粒，粒径范围为1.23至26 nm，平均直径为15.64 ± 4.576 nm。ζ-电位测量表明胶体稳定性良好，表面电荷为?32.6 ± 4.65 mV。热重分析确认了其高热稳定性，而X射线衍射分析验证了所产EuM-NPs的特征性无定形结构。LC–MS/MS分析检测到氧化降解产物吡咯-2,3-二羧酸（PDCA）[m/z 156.9]和吡咯-2,3,5-三羧酸（PTCA）[m/z 199.9]，证实了真黑素衍生结构成分的存在。体内研究表明，其对艾氏腹水癌和实体瘤具有显著的抗癌活性，肿瘤体积减小高达78%，肿瘤重量减轻高达83%。此外，EuM-NPs表现出有效的抗炎活性，对角叉菜胶诱导的大鼠足跖肿胀的抑制率达62.62%。体外环氧化酶抑制试验显示，与COX-1（IC50 > 50 μg/mL）相比，EuM-NPs对COX-2具有选择性抑制作用（IC50 5.61 μg/mL，选择性比率> 8.91）。对七种潜在真黑素5,6-二羟基吲哚（DHI）前体的计算机模拟药物相似性、药代动力学和分子对接分析突显了2,4′-DHI-二聚体是最有前景的化合物，其对COX-1和COX-2的结合亲和力分别为?5.93 kcal/mol和?5.27 kcal/mol。这些发现表明，受控的生物反应器培养显著缩短了灰色链霉菌NEAE-H获得EuM-NPs所需的生产时间，同时保持了相当的生产水平，并强调了其作为用于癌症治疗、炎症管理和未来纳米医学应用的多功能纳米材料的潜力。
论文解读：基于生物反应器的灰色链霉菌NEAE-H产真黑素纳米颗粒的综合研究
**1. 研究背景与目的**
黑色素（Melanin）是一类通过酚类或吲哚类化合物氧化聚合形成的异质性生物聚合物，广泛存在于自然界。基于其化学结构，黑色素主要分为真黑素（Eumelanin）、褐黑素（Pheomelanin）和异黑素（Allomelanin）。其中，真黑素是人体和微生物（尤其是细菌和真菌）产生的主要形式，其生物合成始于L-酪氨酸，经酪氨酸酶等系列酶促及非酶促反应最终形成。真黑素具有独特的理化性质，如负电性疏水表面、对浓酸、光和还原剂的显著抗性以及高热稳定性（部分可耐受高达600°C的分解温度），并展现出紫外线、X射线和γ射线吸收能力，以及作为非晶半导体、药物载体和阳离子交换剂的潜力。在生物学活性方面，真黑素具有抗毒素、抗肿瘤、抗炎、抗菌和清除自由基等多种功能。基于其纳米载体特性，黑色素基纳米材料已被广泛探索用于药物递送、生物成像、组织工程和光热治疗等生物医学应用。
近年来，微生物来源的黑色素生产因其更环保、更经济的特点而受到关注。然而，天然微生物生产可溶性胞外黑色素的产量普遍较低，且使用重组生物受限。放线菌因其能够合成和分泌胞外深色可溶性黑色素而被视为有前景的生产菌株。研究人员的前期研究发现，灰色链霉菌（Streptomyces glaucescens）NEAE-H菌株在摇瓶培养条件下是胞外真黑素的优良生产者，经统计优化后最大产量可达350 mg/L，但培养时间长达6天。然而，在受控生物反应器条件下生产微生物真黑素纳米颗粒（EuM-NPs）的研究仍相对匮乏。因此，本研究旨在探讨在7-L搅拌罐生物反应器中，通过受控发酵条件利用灰色链霉菌NEAE-H菌株生产EuM-NPs的工艺，并对其进行全面的理化特性表征和多层次的生物学活性评价。
**2. 主要关键技术方法**
本研究采用了几项关键技术方法：首先，在7-L搅拌罐生物反应器中，于受控pH（7.0）条件下，通过改变搅拌速度（100、200、300 rpm）进行分批发酵，以优化EuM-NPs的生产。其次，采用多种互补技术对纯化后的EuM-NPs进行表征，包括透射电子显微镜（TEM）结合能量色散X射线光谱（EDX）分析形态和元素组成、动态光散射（DLS）和ζ-电位测量分析水合粒径和胶体稳定性、热重分析（TGA）评估热稳定性、X射线衍射（XRD）分析晶体结构、液相色谱-串联质谱（LC–MS/MS）鉴定化学结构标志物。最后，通过体内动物模型（艾氏腹水癌、实体瘤模型和角叉菜胶诱导大鼠足跖肿胀模型）评估其抗癌和抗炎活性，并结合体外环氧化酶（COX-1和COX-2）抑制试验以及计算机模拟（in silico）分子对接和药代动力学分析，从分子层面探究其作用机制。
**3. 研究结果**
***EuM-NPs在不同搅拌速度和受控pH条件下的生产***
研究考察了不同搅拌速度对灰色链霉菌NEAE-H菌株在生物反应器中生长和产EuM-NPs的影响。结果显示，搅拌速度显著影响生物量积累和产物合成。在200 rpm条件下，获得了最高的EuM-NPs产量，达到367.51 μg/mL，培养时间为22小时。虽然100 rpm条件下也获得了较高产量（约342.91 μg/mL），但所需时间更长且溶解氧（DO）水平较低，可能存在氧传递限制。而过高的搅拌速度（300 rpm）虽能促进初期快速生长并维持高溶解氧，但可能因过度剪切力损伤菌丝体，导致EuM-NPs产量显著降低（最高仅130.12 μg/mL）。
***生物量增长、EuM-NPs生产及非受控pH条件下的溶解氧***
在非受控pH条件下进行发酵，发现生物量在16小时达到最大值7.90 g/L，但整个过程中pH值从7.0持续上升至7.89。EuM-NPs产量在17小时达到峰值（226.10 μg/mL）后便逐渐下降。这表明pH值的持续升高可能偏离了与EuM-NPs生物合成相关酶的最适pH范围，从而限制了产物的进一步积累。
***受控与非受控pH条件下的动力学分析***
通过对受控（pH 7）和非受控pH条件下的发酵过程进行动力学比较分析，结果显示，受控pH条件下的最大生物量（8.26 g/L）、最大EuM-NPs浓度（367.51 μg/mL）、体积产率（Qp，16.70 μg/mL/h）和产物得率系数（YP/X，46.88 μg/g）均显著高于非受控条件。受控pH条件下的EuM-NPs产量比非受控条件提高了约1.63倍，这突显了pH调控作为规模化生产EuM-NPs关键操作参数的重要性。研究还观察到，两种条件下EuM-NPs产量达到最大值时，溶解氧（DO）水平均在20-25%左右，提示适度的氧限制条件可能有利于产物合成。
***EuM-NPs的理化特性表征***
对纯化的EuM-NPs进行了一系列理化特性分析。溶解性测试表明，该色素可溶于水、碱性溶液（如NaOH、KOH）、甲醇和二甲基亚砜（DMSO），但不溶于乙醇、丙酮、氯仿及1N HCl等溶剂，这与其高度交联的疏水性芳香结构一致。稳定性测试显示，EuM-NPs在20-100°C范围内表现出高热稳定性，在长达6小时的暴露后仅出现轻微降解；在避光条件下表现出极佳的光稳定性，而在持续光照下48小时后吸光度仅下降约1.4%；在中性和碱性条件（pH 7–12）下具有出色的稳定性，但在强酸性条件（pH 3）下因颗粒聚集而不稳定。TEM分析显示，EuM-NPs呈近球形，粒径范围1.23至26 nm，平均直径为15.64 ± 4.576 nm。ζ-电位分析测得表面电荷为?32.6 ± 4.65 mV，表明胶体稳定性良好。DLS分析测得Z-平均水合动力学直径为194.7 d.nm，多分散性指数（PDI）为0.328。TGA分析显示EuM-NPs在32.5至800°C范围内呈现五阶段分解，累计重量损失约68.24%，800°C时残余质量为31.76%，证实了其优异的热稳定性。XRD分析显示宽泛的弥散峰，无尖锐晶体衍射峰，证实了其无定形结构。LC–MS/MS分析检测到特征性的氧化降解标志物吡咯-2,3-二羧酸（PDCA，m/z 156.9）和吡咯-2,3,5-三羧酸（PTCA，m/z 199.9），确证了其真黑素化学组成。
***体内抗肿瘤活性（艾氏实体瘤模型）***
在艾氏实体瘤小鼠模型中，EuM-NPs治疗以剂量依赖性方式显著抑制了肿瘤生长。与模型对照组相比，EuM-NPs（20 mg/kg）治疗组的肿瘤体积减少了78%，肿瘤重量减轻了83%，且平均生存时间（MST）从17.2天延长至56.3天。血清生化分析显示，EuM-NPs治疗可降低脂质过氧化标志物丙二醛（MDA）水平，并提高总抗氧化能力（TAC），提示其抗氧化活性可能是抗肿瘤机制之一。组织病理学检查观察到治疗组肿瘤组织坏死区域减少，而免疫组织化学分析显示，EuM-NPs治疗以剂量依赖性方式增强了肿瘤组织中活性caspase-3的表达，表明其可诱导肿瘤细胞凋亡。
***体内抗肿瘤活性（艾氏腹水癌模型）***
在艾氏腹水癌模型中，EuM-NPs（5 mg/kg）治疗显著减少了腹膜腹水体积（减少75%）和活肿瘤细胞计数（减少57%），同时增加了非活细胞计数，并将平均生存时间（MST）从16.5天延长至34天。此外，EuM-NPs治疗部分逆转了EAC诱导的血常规异常，即提高了血红蛋白（Hb）含量和红细胞（RBC）计数，并降低了白细胞（WBC）计数。
***体内抗炎活性（角叉菜胶诱导足跖肿胀模型）***
在角叉菜胶诱导的大鼠足跖肿胀模型中，EuM-NPs（10 mg/kg）预处理显示出显著的抗炎效果，对足跖水肿的抑制率达62.62%，虽略低于阳性对照药双氯芬酸（抑制率82.54%），但仍表现出强效的抗炎活性。
***体外环氧化酶（COX-1/COX-2）抑制活性***
体外酶活性抑制试验结果表明，EuM-NPs对COX-2具有选择性抑制作用，其IC50值为5.61 μg/mL，而对COX-1的IC50值大于50 μg/mL，计算得到的选择性比率（>8.91）远大于1，表明EuM-NPs可作为选择性COX-2抑制剂，这可能是其发挥抗炎作用的潜在机制之一。
***计算机模拟（In Silico）分析***
计算机模拟分析包括药物相似性、药代动力学（ADME/Tox）预测、网络药理学和分子对接。ADME/Tox预测显示，大多数DHI寡聚/聚合片段因结构复杂而不满足Lipinski五规则，仅单体DHI前体被预测为合适的类药候选物。网络药理学分析发现26个与炎症相关的蛋白靶点与DHI片段预测靶点重叠，其中包括前列腺素内过氧化物合酶1/2（PTGS1/PTGS2，即COX-1/COX-2）。分子对接模拟结果显示，在七种测试的真黑素DHI片段中，2,4′-DHI-二聚体对COX-1（结合能ΔG = ?5.93 kcal/mol）和COX-2（ΔG = ?5.27 kcal/mol）均表现出最佳的活性位点结合亲和力，并呈现出与OXICAM类NSAIDs相似的结合模式，涉及COX-1的Arg-120、Tyr-355、Tyr-385和Ser-530或COX-2的Arg-121、Tyr-356、Tyr-386和Met-523残基。
**4. 总结与结论**
本研究成功地在7-L搅拌罐生物反应器中，通过受控发酵条件优化了灰色链霉菌NEAE-H菌株生产EuM-NPs的工艺，将培养时间从摇瓶培养的144小时显著缩短至22小时，同时保持了相当的生产水平。结合动力学分析和全面的理化表征，证实了pH调控和适当搅拌速度是规模化生产的关键参数。体内外实验均证实了所产EuM-NPs具有显著且剂量依赖性的抗癌和抗炎活性，其抗炎活性部分归因于对COX-2的选择性抑制。计算机模拟分析进一步揭示了真黑素DHI衍生结构单元与环氧化酶之间可能的结合模式，提示2,4′-DHI-二聚体是最具潜力的活性结构单元。尽管研究存在局限性，即分子对接使用的是DHI衍生物而非完整的纳米颗粒，但这些发现强有力地支持了经生物反应器优化的EuM-NPs作为一种可持续、多功能的纳米材料，在未来的生物医学和制药应用中，特别是在癌症治疗和炎症管理方面，具有巨大的潜力。
