《Scientific Reports》：Comprehensive proximity proteomics expand the known interactome of the oncoprotein β-catenin
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癌蛋白β-catenin在细胞粘附和细胞信号传导中具有关键作用。β-catenin通过众多相互作用伙伴影响人体生理和病理，其中许多已通过标准亲和纯化蛋白质组学发现。然而，β-catenin的相互作用图景尚未被完全理解，这表明需要新的实验方法来探索β-caten
癌蛋白β-catenin在细胞粘附和细胞信号传导中具有关键作用。β-catenin通过众多相互作用伙伴影响人体生理和病理，其中许多已通过标准亲和纯化蛋白质组学发现。然而，β-catenin的相互作用图景尚未被完全理解，这表明需要新的实验方法来探索β-catenin生物学。邻近蛋白质组学通过质谱法促进发现目标蛋白邻近的分子，最近已成为研究蛋白质-蛋白质相互作用的强大补充工具，但至今尚未应用于β-catenin。研究人员利用含有生物素连接酶BioID和TurboID的表达构建体，通过邻近蛋白质组学研究了模型细胞系中β-catenin的相互作用组。生物素标记后的质谱分析确定了β-catenin的众多候选相互作用因子，包括许多在早期使用标准蛋白质组学研究中未被观察到的因素。富集分析表明，邻近蛋白质组学捕获了与β-catenin已知生物学功能相关的蛋白质，包括细胞粘附、Wnt/β-catenin信号传导和转录调控。本研究产生的分子工具和数据为β-catenin生物学提供了新见解，并突出了值得进一步探索的β-catenin功能潜在新调控因子。
β-catenin作为一种高度保守的支架蛋白，在细胞粘附和细胞信号传导中发挥关键功能。在质膜上，β-catenin作为衔接分子将E-钙粘蛋白与α-catenin连接于粘附连接中；在细胞质中，β-catenin是Wnt/β-catenin信号通路中TCF/LEF家族转录因子的必需转录共因子。Wnt/β-catenin信号促进干细胞维持和更新，而在分化细胞中通过多蛋白降解复合物介导的β-catenin蛋白酶体组成性降解来限制其信号强度。增加β-catenin稳定性的自发突变与多种癌症的发病机制密切相关，尤其是结直肠癌，大多数肿瘤由异常Wnt/β-catenin通路激活引发。尽管β-catenin已被广泛研究数十年，其功能和调控已基本明确，但组织特异性调控、亚细胞运输的精确模式等仍待解决。
传统研究中，基于亲和纯化/质谱(AP-MS)的蛋白质组学方法在鉴定β-catenin相互作用因子方面发挥了关键作用，然而，β-catenin的相互作用景观仍未完全阐明。近期出现的邻近蛋白质组学技术，利用生物素连接酶BioID及其衍生物TurboID在活细胞中对目标蛋白邻近蛋白质进行稳定标记，通过链霉亲和素拉下和质谱分析鉴定相互作用蛋白，可作为AP-MS的互补方法。由于两种方法捕获的相互作用组大多不同但均具有生物学意义，研究人员将邻近蛋白质组学应用于β-catenin研究，以扩展其已知的相互作用组并发现新的调控因子。
研究人员首先通过限制性酶切和T4 DNA连接酶克隆，构建了N端或C端融合BioID或TurboID且含Flag表位标签的人β-catenin全长cDNA表达质粒，并通过Sanger测序验证。使用CRISPR-Cas12a基因编辑方法构建了内源性CTNNB1-TurboID标签的293T细胞系。通过免疫印迹、亚细胞分级分离、免疫荧光显微镜检测融合蛋白表达和定位，采用TOPflash荧光素酶报告基因实验验证融合蛋白功能。邻近标记实验在293T细胞中进行，使用Lipofectamine 2000转染表达构建体，BioID标记用50μM生物素处理18小时，TurboID标记用500μM生物素处理0.5或3小时。细胞裂解后经链霉亲和素珠子拉下、胰蛋白酶消化，分别使用LTQ Orbitrap Velos Pro混合质谱仪和Q Exactive HF混合四极杆-Orbitrap质谱仪进行质谱分析。蛋白质鉴定和定量采用Proteome Discover 2.0及Sequest HT搜索，数据经SAINTexpress分析、CRAPome数据库去污、clusterProfiler进行GO富集分析。HCT116细胞进行邻近连接实验(PLA)验证β-catenin-ABCF2原位相互作用，DLD1细胞采用siRNA敲低ABCF2后评估Wnt转录活性。293T和HCT116细胞获自德国微生物和细胞培养物保藏中心(DSMZ)，DLD1细胞由Link?ping大学Xiao-Feng Sun博士赠送。
**Construction and validation of BioID and TurboID fused to β-catenin**
免疫印迹确认了融合蛋白以预期分子量表达；亚细胞分级分离显示TurboID融合蛋白定位于细胞质和细胞核，且不影响内源性β-catenin丰度；生物素处理后各构建体产生均匀的蛋白质生物素化。TOPflash报告实验证实所有构建体均激活TCF报告基因，证明其功能活性，但C端融合构建体活性降低，这可能是由于标签干扰了β-catenin的转激活结构域。通过CRISPR-Cas12a基因编辑成功构建了内源性TurboID标签的293T单克隆细胞系，免疫荧光观察到加入生物素后广泛的链霉亲和素标记。
**Exploration of the β-catenin interactome using BioID**
通过BioID-CTNNB1瞬时表达和18小时生物素标记，质谱鉴定到748个独特蛋白质，去除CRAPome数据库中常见污染物后剩324个蛋白质，其中73%在至少两个生物学重复中被检出。SAINTexpress分析突出34个显著富集的候选相互作用因子，包括已知的细胞连接相关蛋白质(α-catenin、γ-catenin、N-钙粘蛋白)和Wnt/β-catenin通路蛋白质(APC、ICAT、DVL-2)。GO分析显示这些蛋白质主要涉及细胞信号传导、细胞粘附和转录调控，与β-catenin的已知功能一致。
**Further exploration of the β-catenin interactome using TurboID**
使用N端或C端TurboID融合构建体，分别进行0.5小时和3小时生物素标记，共鉴定3,287个独特蛋白质，去除污染物后剩2,524个。TurboID结构域位置对发现结果影响不大，两种标记时间下蛋白质谱图相似，但较长标记时间显著增强了Wnt信号通路中已知β-catenin相互作用因子的检测，表明延长标记时间有助于捕捉细胞质和核内相互作用因子。结构蛋白质(α/δ-catenin、scribble、afadin)在正常化光谱计数中最高，提示邻近生物素化可能优先鉴定质膜相关β-catenin的相互作用因子。内源性TurboID标签细胞系仅鉴定到两个显著富集蛋白质(DCAF7和RAB11A)，未检测到诱饵蛋白β-catenin，可能因其在未刺激细胞中的丰度较低。
**Comparison of proximity proteomics with affinity purification proteomics data**
将邻近蛋白质组学数据与七项已发表的β-catenin AP-MS研究比较发现，TurboID结果与AP-MS相当，检出了细胞质β-catenin降解复合物组分(APC、β-TrCP、GSKα/β)、核Wnt增强体成分(ICAT、SMARCA4)和细胞连接蛋白。值得注意的是，未检测到四种β-catenin相关TCF/LEF转录因子，这可能是因为大蛋白质复合物的某些组分被空间遮蔽而无法被生物素标记。与两项采用类似分析策略的近期研究(Panelli等和Semaan等)的交叉比较显示，各研究间共享的高置信度相互作用因子很少，但每项研究均鉴定到独特的且有生物学意义相互作用因子。
**Proximity proteomics prioritise potential new β-catenin interactors**
对合并的BioID和TurboID数据进行无监督层次聚类，数据分为两个不同簇：簇1包含在所有实验中高水平检出的蛋白质，包括多个已知细胞粘附β-catenin相互作用因子；簇2由在TurboID实验中随标记时间延长而光谱计数增加的蛋白质组成，其中约18%已被验证为β-catenin相互作用因子。簇1中的ABCF2未先前被鉴定为β-catenin相互作用因子。免疫共沉淀未检出稳定的β-catenin/ABCF2复合物，但在HCT116细胞中进行的原位PLA实验显示二者存在广泛且普遍的邻近关系。此前全基因组RNA干扰筛选提示ABCF2敲低可显著降低DLD1结直肠癌细胞中Wnt通路活性。使用两种独立siRNA在DLD1细胞中敲低ABCF2后，β-catenin转录活性一致性地降低约20%(尽管未达统计学显著性)。综合表明ABCF2可能是β-catenin相互作用蛋白并作为Wnt/β-catenin信号的正调控因子。
讨论部分指出，邻近蛋白质组学相比AP-MS的主要优势在于不要求蛋白质复合物在细胞裂解和分离过程中维持完整，从而可捕获瞬时或低亲和力相互作用因子；TurboID的短标记时间有助于特定生物学背景下研究蛋白质-蛋白质相互作用。但蛋白质生物素化仅反映空间邻近(约10nm标记半径)而非必然的相互作用，需经验性验证。未检测TCF/LEF转录因子可能归因于标签干扰转录复合物装配或这些蛋白质丰度/溶解度低。ABCF2作为ATP结合盒(ABC)家族非典型成员，缺乏跨膜结构域而定位在细胞质和细胞核，在卵巢癌和乳腺癌中的病理关联与Wnt/β-catenin驱动癌症有关，且在K562细胞AP-MS数据中被检测为候选β-catenin相互作用因子。研究结论认为，邻近蛋白质组学是研究β-catenin生物学的重要互补工具，将促进发现依赖于稳定相互作用才能检出的功能性β-catenin相互作用因子，为β-catenin依赖性癌症的新治疗靶点鉴定提供帮助。
