综述：调节性T细胞诱导策略及其在免疫性和非免疫性疾病治疗中的应用

《Signal Transduction and Targeted Therapy》：Regulatory T cell induction strategies and applications in the treatment of immune and non-immune diseases

　　

摘要：作为免疫系统的关键调节因子，调节性T细胞（Treg cells）通过接触依赖性和非接触依赖性等多种免疫抑制机制，抑制过度免疫反应并维持自身耐受。Treg细胞在免疫相关疾病及部分非免疫性疾病中展现了显著的治疗潜力。本文中，研究人员系统综述了Treg细胞的诱导策略，涵盖抗原刺激、细胞因子调节、代谢通路、表观遗传调控、药物诱导及工程化技术等多个方面。尽管每种策略各有优势，但单一策略无法全面解决Treg细胞稳定性、靶向特异性及规模化生产等复杂问题。因此，研究人员提出，在Treg细胞诱导过程中整合多种诱导策略，对于设计具有更优功能和更广泛应用范围的Treg细胞疗法至关重要，从而克服当前Treg细胞治疗面临的诸多限制。此外，研究人员还介绍了Treg细胞在免疫性疾病（如自身免疫病、器官移植、过敏性哮喘和癌症）及非免疫性疾病（如胰岛素抵抗、组织修复、纤维化疾病和骨质疏松症）中的治疗应用及最新进展，并讨论了基于Treg细胞的治疗策略目前面临的研究瓶颈，展望了其未来发展方向，旨在加深对Treg细胞的理解，推动基于Treg细胞的细胞治疗策略的进步。

Treg细胞的免疫抑制功能

目前认为，Treg细胞通过接触依赖性和接触非依赖性两种抑制机制发挥免疫调节功能。Treg细胞可通过高表达细胞毒性T淋巴细胞相关抗原-4（CTLA-4）下调抗原提呈细胞（APCs）表面的共刺激分子CD80/CD86，从而抑制免疫反应。CD80/CD86信号的减弱可增加APCs上的程序性死亡配体1（PD-L1），进而抑制表达程序性死亡受体1（PD-1）的效应T细胞功能。淋巴细胞活化基因-3（LAG-3）可结合DCs表面的主要组织相容性复合体（MHC）-II类分子，抑制树突状细胞（DCs）成熟和活化，降低其抗原提呈能力。此外，抗原特异性Treg细胞与DCs的强相互作用可移除DCs表面的抗原肽-MHC复合物（pMHC），进一步抑制免疫应答。在肿瘤微环境中，Treg细胞可通过颗粒酶B或穿孔素依赖性方式诱导效应T细胞死亡。Treg细胞还可通过分泌白细胞介素10（IL-10）、白细胞介素35（IL-35）及转化生长因子β1（TGF-β1）等免疫抑制性细胞因子发挥非接触依赖性抑制作用。Treg细胞表面的CD39/CD73可协同水解细胞外三磷酸腺苷（ATP）生成腺苷，通过腺苷A2A受体（A2AR）抑制效应细胞活性。此外，Treg细胞表面高表达高亲和力白细胞介素2（IL-2）受体，通过竞争性消耗IL-2抑制CD8⁺ T细胞反应。研究表明，抗原特异性Treg细胞在感染期间可先于表达相同T细胞受体（TCR）的传统T细胞（Tconv细胞）扩增，通过竞争自身抗原pMHC复合物和IL-2，抑制相同抗原特异性的Tconv细胞增殖和分化，从而在保证病原体清除的同时维持自身耐受。不同诱导方式产生的Treg细胞其免疫抑制机制可能存在差异，例如多克隆胸腺来源Treg细胞（tTreg细胞）通过下调趋化因子受体抑制Tconv细胞向淋巴结迁移，而诱导性Treg细胞（iTreg细胞）则主要通过IL-10依赖性途径抑制DCs的抗原提呈功能。

Treg细胞的表型

叉头框蛋白3（Foxp3）是Treg细胞发育和功能的关键转录因子。人类X染色体异常导致的免疫失调、多内分泌腺病、肠病、X连锁（IPEX）综合征由Foxp3基因突变引起。Foxp3不仅为Treg细胞初始分化所必需，也为维持成熟Treg细胞的表型特征和抑制功能所必需。Foxp3基因的mRNA受启动子和保守非编码序列0-3（CNS0-3）等五个元件调控。IL-2信号可汇聚至增强子CNS0，促进胸腺内Treg前体细胞转化为Treg细胞。TGF-β介导的Smad信号通路中，Smad2/3与Smad4形成复合物转位至细胞核并结合CNS1区域，启动Foxp3转录。

不同组织驻留的Treg细胞表现出不同表型。肠道组织存在Helios⁺ Treg细胞和RORγ⁺ Treg细胞两个主要亚群，其中Gata3⁺ Helios⁺ Treg细胞的免疫调节功能严格依赖Foxp3且不受肠道菌群调控，而RORγ⁺ Treg细胞受菌群调控且功能仅部分依赖Foxp3。内脏脂肪组织（VAT）中的Treg细胞高表达过氧化物酶体增殖物激活受体γ（Ppar-γ）及特定趋化因子受体谱。淋巴结中多数Treg细胞为循环性，10%-20%呈组织驻留记忆T细胞（TRM）表型。少量人类Treg细胞可分泌IL-17和IFN-γ，但仍保留免疫抑制功能，CD161可作为这类Foxp3⁺ Treg细胞的标志。尽管不同Treg细胞亚群具有高度表型异质性，CD4⁺ CD25⁺ Foxp3⁺仍被认为是Treg细胞的核心表型。然而，Foxp3表达水平与抑制功能并不总成正比，Foxp3⁺ T细胞即便表达高且稳定的Foxp3仍可能缺乏免疫抑制功能。1型调节性T细胞（Tr1）不组成性表达Foxp3，通过不依赖Foxp3的方式分泌IL-10发挥调节作用。此外，CD127低表达、Helios、CTLA-4、诱导性协同刺激分子（ICOS）、CD39、肿瘤坏死因子受体2型（TNFR2）、LAG-3及重组糖蛋白A33（GPA33）等均为常用Treg表面标志，但许多标志并非Treg细胞所特有，因此定义Treg细胞应将表型与其免疫抑制功能相结合。

CD8⁺调节性T细胞

CD8⁺ Treg细胞可分为Foxp3⁺ CD8⁺ Treg细胞和Foxp3^? CD8⁺ Treg细胞。稳态下健康人外周血中Foxp3⁺ CD8⁺ Treg细胞约占T细胞的0.4%，其免疫抑制机制与Foxp3⁺ CD4⁺ Treg细胞相似，同时保留类似CD8细胞毒性T细胞的细胞毒活性。Ly49⁺ CD8⁺ Treg细胞是典型的非Foxp3 CD8⁺ Treg细胞，可通过TCR识别表达Qa-1/肽复合物的CD4⁺ T细胞并以穿孔素介导的细胞毒性将其清除。Helios转录因子通过激活STAT5b/IL-2Rα通路维持Ly49⁺ CD8⁺ Treg细胞的表型和免疫调节活性。人体扁桃体来源免疫类器官的研究显示，CD4⁺ Treg细胞主要控制自身反应性B细胞以维持体液免疫耐受，而CD8⁺ Treg细胞则通过颗粒酶B介导的毒性抑制自身反应性T细胞扩增和活化，二者功能互补。由于CD4⁺ Treg细胞研究最为深入，本综述重点聚焦CD4⁺ Treg细胞。

Treg细胞诱导策略及整合途径

Treg细胞诱导策略主要面临三大挑战：诱导Treg细胞在体内的抑制功能持久性、靶向特异性及规模化生产困难。单一诱导策略难以全面克服这些障碍，整合多种诱导策略有望设计出功能更优、适用性更广的Treg细胞疗法。Mikami等通过整合抗原刺激（抗CD3抗体）、IL-2和TGF-β细胞因子、CDK8/19抑制剂（Senexin A）增强STAT5信号、去除CD28共刺激以促进Foxp3 CNS2区域DNA去甲基化，并在静息培养后加入抗FasL抗体防止活化诱导的细胞死亡，成功在小鼠中将效应T细胞高效诱导为稳定的抗原特异性iTreg细胞。针对人类Tconv细胞效率较低的问题，该策略进一步联合维甲酸（RA）和维生素C（TET去甲基化酶辅因子）优化，在人类细胞中亦获得理想的iTreg细胞诱导效果。

胸腺Treg细胞分化

tTreg细胞在胸腺中的分化成熟分为两个阶段：TCR依赖阶段和TCR非依赖阶段。TCR依赖阶段中，表达自身抗原肽MHC-II中等亲和力TCR的胸腺细胞识别APCs（如mTECs、CD8α⁺ DCs、SIRPα⁺ DCs）提呈的pMHC，并接受CD80/CD86共刺激信号，分化为CD4⁺ CD25⁺ Foxp3^? Treg前体细胞。TCR非依赖阶段中，Treg前体细胞响应IL-2和IL-15等细胞因子表达Foxp3，成熟为具有免疫抑制功能的Treg细胞。胸腺自身免疫调节因子（Aire）通过诱导mTECs表达组织特异性抗原促进tTreg细胞分化。TCR信号通过PLCγ1水解PtdIns(4,5)P?产生DAG和IP?，激活PKCθ-CARMA1-Bcl-10-MALT1复合物及NF-κB通路，同时IP?诱导钙离子释放并活化钙调磷酸酶，促进NFAT去磷酸化入核，与Smad3协同诱导Foxp3表达。短暂且不连续的TCR刺激有利于Foxp3稳定表达，持续TCR信号则使Foxp3基因转录起始位点附近的H3K4二甲基化和三甲基化丢失，抑制Foxp3表达。CD28与CD80/86结合后通过Lck激活NF-κB促进tTreg生成。IL-2在tTreg发育中不可替代，IL-15可发挥类似作用但二者功能非冗余。成熟tTreg细胞表达CCR4和CCR7等归巢受体，部分外周Treg细胞可通过CCR6和CXCR3依赖机制重返胸腺，通过竞争性消耗IL-2形成负反馈环调节胸腺内Treg发育。炎症条件下，表达IL-1R2的再循环Treg细胞可中和IL-1β，保护新生tTreg细胞的发育。胸腺损伤时，tTreg细胞通过分泌双调蛋白（AREG）激活胸腺上皮细胞和成纤维细胞上的EGFR，促进胸腺再生。

抗原刺激诱导

TCR信号在Treg细胞诱导中发挥关键作用。抗原特异性iTreg细胞可通过将已知抗原、初始T细胞和DCs在TGF-β存在下共培养获得。与广泛免疫抑制相比，抗原特异性Treg细胞介导的免疫耐受具有靶向性且副作用较少。纳米递送技术（如共递送芳基烃受体（AhR）配体ITE和β细胞抗原前胰岛素的纳米颗粒、负载修饰尿苷的mRNA脂质体）可在体内诱导耐受性DCs和抗原特异性Treg细胞生成。口服免疫治疗（OIT）通过逐渐递增过敏原剂量诱导抗原特异性Treg细胞产生，有望成为食物过敏的根治性疗法。然而，许多自身免疫病的靶抗原尚未明确，且可能因人而异，限制了抗原特异性Treg细胞的应用。

细胞因子调节

IL-2是Treg细胞诱导的关键细胞因子。IL-2与高亲和力IL-2受体（IL-2R）结合后激活JAK1/3，促使STAT5磷酸化、二聚化并入核，激活Foxp3基因表达。Treg细胞高表达CD25，对低剂量IL-2高度敏感，因此低剂量IL-2可优先激活Treg细胞，用于治疗自身免疫病和移植排斥。但IL-2半衰期短且存在脱靶效应。为克服此限制，研究者开发了抗IL-2抗体（如JES6-1、F5111及高亲和力变体F5111.2）和工程化IL-2突变蛋白（IL-2 mutein），通过降低与CD122/CD132的亲和力，选择性扩增Treg细胞。TGF-β是另一个关键诱导因子。TGF-β通过Smad2/3磷酸化并激活Foxp3-CNS1区域诱导Foxp3表达，还可通过Smad2/3/PGC-1α通路诱导线粒体融合，抑制缺氧诱导因子1α（HIF-1α），促进代谢重编程从糖酵解转向脂肪酸氧化，从而诱导Treg细胞生成。维甲酸（RA）可增强TGF-β诱导的iTreg细胞生成并抑制Th17分化。IL-10可通过抑制PI3K/Akt信号增强Foxo1功能，促进Treg细胞增殖和发育。IL-35可诱导产生iTR35细胞，该细胞不表达Foxp3但具有强大的稳定性和免疫抑制能力。细胞因子策略不能赋予抗原特异性，且表观维持不稳定，需与表观遗传调控和代谢重编程等策略整合。

代谢通路

哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信号通路是Treg细胞代谢重编程的核心调控节点。增强的mTOR活性通过HIF-1α促进糖酵解并下调Foxp3表达。TSC1缺失可导致Treg细胞丢失Foxp3并转化为分泌促炎因子的Tconv细胞。PTEN缺失导致mTORC2过度激活，使Treg细胞不稳定。相反，雷帕霉素抑制mTOR可促进Foxp3表达，孕酮（P4）亦通过负调控mTOR诱导iTreg细胞生成。但Treg细胞增殖仍需适宜的mTOR活性以支持胆固醇和脂质代谢。肝激酶B1（LKB1）通过调控氧化磷酸化和甲羟戊酸途径维持Treg细胞稳定性与功能。肠道菌群代谢色氨酸产生的衍生物可激活AhR，诱导肠道Treg细胞生成，并通过肠-胎盘轴等途径影响全身免疫微环境。乳酸是重要的代谢信号分子。肿瘤微环境中，肿瘤浸润Treg细胞（TI-Tregs）通过MCT1摄取乳酸并转化为丙酮酸，进入三羧酸循环促进氧化磷酸化，还可将乳酸来源的碳掺入磷酸烯醇式丙酮酸（PEP），上调PD-1转录并增强免疫抑制功能。体外扩增人Treg细胞时添加乳酸可显著提高Treg细胞纯度、存活率和免疫抑制功能。

表观遗传调控

Treg细胞表型和功能的稳定性依赖Foxp3基因的表观遗传调控。Foxp3基因CNS2区域内富含CpG序列，称为Treg特异性去甲基化区（TSDR）。tTreg细胞中TSDR完全去甲基化，而iTreg细胞该区域常去甲基化不足，是iTreg细胞Foxp3表达不稳定、易丢失免疫抑制功能的主要原因。TGF-β活化的Smad3和IL-2活化的STAT5促进Tet1/Tet2与Foxp3结合，将5-甲基胞嘧啶（5mC）转化为5-羟甲基胞嘧啶（5hmC），促进TSDR去甲基化。维生素C、氢化硫及强TCR刺激可增强Tet酶活性，稳定Foxp3表达。使用CRISPR-TET1技术介导TSDR去甲基化或CRISPR/dCas9激活Foxp3转录均可增强iTreg细胞稳定性和抑制功能。Foxp3启动子区组蛋白乙酰化由组蛋白乙酰转移酶（HATs）和组蛋白去乙酰化酶（HDACs）共同调控。HDAC抑制剂（如曲古抑菌素A）可促进Treg细胞发育。CBP/p300作为HATs通过乙酰化Foxp3基因内H3K27开放染色质，维持Treg细胞功能。肠道菌群代谢物短链脂肪酸（SCFAs）中的丙酸盐和丁酸盐可抑制HDAC，诱导Foxp3启动子和CNS1区域组蛋白H3乙酰化。胆汁酸代谢物异别石胆酸（isoalloLCA）通过增加线粒体活性氧（mtROS），促进Foxp3基因增强子CNS3区域H3K27乙酰化，经NR4A1依赖性方式促进Foxp3转录。

工程化技术（CAR-Treg）

嵌合抗原受体（CAR）技术为Treg细胞的大规模生产和抗原特异性富集提供了可能。CAR-Treg细胞制备通常经MACS或FACS从外周血单个核细胞分选CD4⁺ CD25⁺ Treg细胞，通过病毒载体、非病毒电转或CRISPR-Cas9基因编辑引入CAR基因，并在体外扩增。加入mTOR抑制剂雷帕霉素可选择性去除Tconv细胞，提高CAR-Treg纯度。CD28共刺激结构域比4-1BB更能维持人CAR-Treg的抑制功能。但CAR表达可引发强持续性背景信号，导致Akt/mTOR通路过度激活，降低Treg谱系稳定性。体外扩增阶段短暂给予维生素C和雷帕霉素可部分恢复CAR-Treg体内抑制功能并延长其存活。降低CAR抗原结合亲和力可减少促炎细胞因子产生，使CAR-Treg更接近天然TCR/CD28活化Treg的表型。外周血Treg数量不足、转染效率低、体内持久性差、质量控制体系不完善及生产成本高等问题仍是CAR-Treg规模化生产的主要障碍。

诱导和增强Treg细胞的药物

除上述策略中涉及的药物外，目前报道可有效诱导和增强Treg细胞的药物还包括其他多种试剂和药物（原文表2），它们部分通过前述机制，部分通过其他或组合机制发挥诱导Treg细胞分化、增殖和功能维持的作用。

Treg细胞在免疫治疗中的应用及挑战

Treg细胞在免疫性疾病中的核心作用是抑制过度免疫和恢复免疫稳态。自身免疫病、器官移植和过敏性哮喘等疾病中Treg细胞数量或功能常不足，需诱导扩增；而肿瘤和感染性疾病中Treg细胞过度浸润或功能过强，需选择性清除或诱导其功能障碍。

自身免疫病

系统性红斑狼疮（SLE）患者中Treg细胞数量减少、免疫抑制功能受损，且与疾病严重程度正相关。T细胞来源外泌体中杀菌/通透性增加蛋白（BPI）过表达通过上调ZFP36L2下调Helios转录，抑制Treg分化。低剂量IL-2可选择性纠正SLE患者的Treg缺陷，相关临床试验（如NCT02955615、NCT03312335）显示其可改善疾病活动度。低剂量IL-2联合雷帕霉素较单药能更持久地升高Treg细胞。1型糖尿病（T1DM）中，胰岛自身免疫时miR142-3p升高，通过抑制Tet2并上调Foxp3-CNS2甲基化水平使Treg细胞失稳。针对新发T1DM患者的2期临床试验（NCT02691247）显示单次输注多克隆扩增Treg细胞未能阻止疾病进展，提示Treg细胞质量而非剂量是疗效关键。基因编辑构建的抗原特异性Treg细胞疗法（GNTI-122）在糖尿病小鼠模型中显示出良好治疗效果。多发性硬化（MS）患者Treg细胞增殖潜能显著降低，与IL-2-IL-2R-STAT5信号受损及mTOR通路异常激活有关。PRDM1-S上调SGK1表达，通过抑制Foxo1磷酸化使Foxp3去稳定。含雷帕霉素和F5111 IC及自身抗原肽/MHC-II类分子复合物的可生物降解微球可选择性激活抗原特异性Treg细胞，有效预防和缓解实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）。抗TIGIT抗体与IL-2/JES6-1复合物构建的免疫开关纳米调节剂可靶向Treg细胞并选择性促增殖。一项I期临床研究（EudraCT：2014-004320-22）证实鞘内注射新鲜分离Treg细胞治疗MS的可行性。阿仑珠单抗通过诱导淋巴细胞耗竭后免疫重建，使CD4⁺ Treg细胞比例显著增加，Teff/Treg比值下降，实现长期疗效。类风湿关节炎（RA）患者滑液中Treg细胞频率升高但效应T细胞对Treg抑制存在抵抗，外周血Treg细胞功能受损。低剂量IL-2（NCT01988506）和阿托伐他汀可恢复RA患者Treg细胞数量和功能。低剂量IL-2联合IL-6受体拮抗剂妥珠单抗在升高Treg的同时降低Th1/Th2/Th17水平，使Th17/Treg比值下降，适用于高Th2和Th17介导的免疫紊乱患者。

器官移植

Treg细胞输注和低剂量IL-2疗法在移植排斥中均有临床研究。慢性移植物抗宿主病（cGVHD）患者中，低剂量IL-2显著上调Treg细胞数量。在急性GVHD预防中，2期临床试验（NCT01660607）显示Treg细胞联合他克莫司优于Treg单药治疗。供者Treg细胞联合CD34⁺造血干细胞在Tconv细胞输注前给予，可降低急慢性GVHD发生率。肾移植（NCT02371434）和肝移植（NCT02166177）中输注受体Treg细胞安全可行。然而，一项肝移植术后稳定期患者低剂量IL-2临床试验（NCT02949492）虽显著增加循环Treg细胞，但未增加供者特异性Treg细胞及肝脏靶向归巢，还触发肝脏IFN-γ介导的炎症反应，受试者在停用他克莫司后均出现免疫排斥，试验提前终止，提示细胞因子策略的脱靶效应和缺乏靶向性是临床转化的关键障碍。

过敏性哮喘

过敏性哮喘患者中Treg/Th2/Th17免疫平衡被破坏。变应原和环境污染物可诱导Treg细胞表达Notch4，激活下游Wnt和Hippo通路，驱动Treg向Th17和Th2分化，加重气道炎症。哮喘生物标志物溶血磷脂酰甘油18:0（LPG 18:0）通过NAD⁺/SIRT1通路影响Foxp3乙酰化，诱导线粒体功能障碍并损害Treg功能。高剂量鞭毛蛋白B（FlaB）以TLR5依赖性方式诱导调节性DCs，在IL-10存在下促进Treg细胞生成，改善哮喘症状。共载抗原mRNA和雷公藤红素的脂质纳米颗粒（LNP）疫苗可诱导脾脏DCs耐受表型和抗原特异性Treg细胞，并促进其向肺部迁移，有效缓解过敏性哮喘。

癌症

肿瘤组织中Treg细胞大量浸润，通过建立针对肿瘤细胞的免疫耐受促进肿瘤免疫逃逸。癌症免疫治疗策略主要通过抗CTLA-4抗体清除瘤内Treg细胞、阻断TIGIT、抑制CCR4和CCR8等趋化因子受体减少Treg浸润，以及靶向CD25恢复Treg/Tconv平衡。应用磷脂酰肌醇3-激酶δ（PI3Kδ）抑制剂AMG319的临床试验（EudraCT no. 2014-004388-20）显示其可降低肿瘤内Treg细胞并增强CD8⁺ T细胞细胞毒性，但部分患者出现免疫相关不良事件（irAEs）。值得注意的是，并非所有肿瘤均对Treg清除策略应答。在自发胰腺癌小鼠模型中，Treg清除反而加速肿瘤进展，这可能与成纤维细胞重编程、趋化因子CCL3/CCL6/CCL8介导的髓系细胞代偿性免疫抑制及Th2型促肿瘤反应增强有关，提示Treg在肿瘤免疫微环境中的作用具有双重性。