摘要
RIBEYE 是突触丝的核心构建模块，突触丝是带状突触特有的突触前特化结构（带状突触即以此命名）。RIBEYE 由两个主要的蛋白区域组成：一个独特的氨基末端富脯氨酸 A 结构域和一个羧基末端 NADH 结合 B 结构域，后者与形成四聚体的核蛋白 CtBP2 序列高度一致。在 RIBEYE 敲除小鼠中，突触丝完全缺失，这强调了 RIBEYE 在形成突触丝中的核心作用。在本研究中，我们使用了一个先前构建的转基因 RIBEYE 小鼠品系，其中一个大蛋白标签融合到了 RIBEYE-B 结构域的羧基末端（RIBEYE-C-TG）。我们构建了表达 RIBEYE-C-TG 的 RIBEYE 敲除小鼠，以研究 RIBEYE B 结构域羧基末端标记对突触丝形成的影响。我们应用了高分辨率共聚焦免疫荧光显微镜、常规透射电子显微镜和 E-PTA 透射电子显微镜，来分析羧基末端标记的 RIBEYE-C-TG 是否能挽救 RIBEYE 敲除小鼠中的突触丝缺失，并原位恢复突触丝。高分辨率免疫荧光显微镜检查显示，转基因 RIBEYE-C-TG 的表达挽救了 RIBEYE 敲除小鼠中的突触丝形成。电子显微镜确认了由转基因 RIBEYE-C-TG 组成的转基因突触丝得以形成，锚定于活性区，并与突触囊泡相关。但是，由 RIBEYE-C-TG 形成的转基因突触丝在尺寸上明显小于对照小鼠的突触丝。定性及定量 Western blot 分析表明，RIBEYE-C-TG 蛋白的表达水平远低于未标记的 RIBEYE 蛋白。RIBEYE-C-TG 蛋白表达水平的降低并非由于转基因 RIBEYE 启动子活性降低或 5′-UTR 改变所致，RIBEYE 转录本的 RT-qPCR 分析和报告基因测定显示了这一点。我们的发现表明，羧基末端标记的 RIBEYE-C-TG 蛋白比未标记的 RIBEYE 蛋白更不稳定，且在形成突触丝方面效率更低。基于本研究的发现以及其他小组最近发布的关于 RIBEYE 和 RIBEYE B 结构域/CtBP2 的结构数据，我们预测 RIBEYE B 结构域的羧基末端标记位于 RIBEYE B 结构域四聚体/RIBEYE B 结构域丝状物的相互作用界面，可能会干扰 RIBEYE B 结构域依赖性寡聚复合物的形成和/或稳定性，这些复合物很可能是构建突触丝所必需的。
