黑水虻源抗菌肽对食源性相关细菌的分子与功能表征

《Foods》：Molecular and Functional Characterization of Black Soldier Fly Derived Peptide Against Food-Relevant Bacteria

　　

微生物污染仍是食品体系中的一大挑战，催生了对稳定天然抗菌剂的需求。研究人员探究了亮斑扁角水虻（Hermetia illucens）的诱导型抗菌应答，并对黑水虻防御素样肽DLP4进行了表征。幼虫经金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）或大肠杆菌（Escherichia coli）攻毒，评估了血淋巴活性、抗菌肽基因表达、C18固相萃取（SPE）组分及液相色谱-串联质谱（LC–MS/MS）谱图。进一步评估了合成成熟DLP4的抗菌谱、理化稳定性及结构特性。血淋巴抗菌活性随处理和时间变化，而DLP4与CLP1呈差异化转录响应。抗菌活性集中于早期组分，其中F3活性最高。LC–MS/MS在F3中检获保守DLP家族基序及富含半胱氨酸的防御素样肽，并确证了合成DLP4完整40氨基酸序列。DLP4对革兰氏阳性菌（包括枯草芽孢杆菌 Bacillus subtilis、伊万诺夫李斯特菌 Listeria ivanovii 及葡萄球菌属 Staphylococcus spp.）表现出强菌株依赖性活性，对所试大肠杆菌株未检出最小抑菌浓度（MIC）终点。DLP4在热、紫外、储存、pH、NaCl及多数金属离子处理后仍保留实质活性，但Fe3+降低其活性。上述发现支持DLP4作为稳定、靶向革兰氏阳性的抗菌候选物，供食品体系进一步评价。

研究背景与动因

微生物污染贯穿农牧与食品供应链，导致食源性疾病、腐败与经济损耗。传统热处理、高压、化学防腐剂等可能损害感官与营养，尤其不利于 minimally processed foods（最低程度加工食品）。抗菌肽（AMP，antimicrobial peptide）因低浓度强效、结构多样受关注，但新肽能否用于食品需明确其分子身份、抗菌谱、结构-功能关系及加工稳定性。昆虫依赖先天免疫，黑水虻（BSF，Hermetia illucens）幼虫可转化有机副产物且携带多样AMP基因（防御素样、天蚕素样、attacin样、diptericin样）。其中防御素样肽4（DLP4，defensin-like peptide 4）由GenBank KF805350.1编码，预测为短链富半胱氨酸强阳离子成熟肽，但其是否真实存在活性形式、抗菌谱与食品相关理化稳定性均未被实验确证。该研究即在此缺口下，将细菌攻毒、血淋巴活性、基因表达、生物导向分离与合成肽功能验证整合于同一框架，发表于《Foods》。

主要技术方法概览

研究人员以人工饲养至8日龄BSF幼虫为样本队列，设未处理、针刺伤、NaCl注射对照及金黄色葡萄球菌ATCC 6538/大肠杆菌ATCC 8739不同OD₆₀₀攻毒组，于24/48/72 h收集血淋巴（约1000幼虫/池，3独立池）。依次采用琼脂纸片扩散法测血淋巴抑菌圈（ZOI）、RT-qPCR测DLP4/CLP1转录、C18-SPE分步洗脱分得F1–F10并以纸片法定位活性、SDS-PAGE与LC–MS/MS（Q-Exactive，Top20 DDA）鉴定F3及合成DLP4序列、肉汤微稀释法测合成DLP4对多株革兰氏阳/阴性菌MIC、纸片法评估DLP4经紫外/储存/热/pH/盐/金属离子后相对ZOI、SignalP/ProP预测前体加工、ExPASy/NetSurfP/AMP Scanner/CAMP做序列与倾向分析、ColabFold-AlphaFold2与AlphaFold Server建模、PPM 3.0膜定位、远紫外圆二色（CD）光谱测构象响应。

研究结果分述

3.1 诱导窗口：OD₆₀₀=3.0攻毒致24 h内全死亡，定为致死边界，排除出后续表型分析，选用OD₆₀₀ 2.5及以下做机制研究。

3.2 血淋巴抗菌活性：针对S. aureus与E. coli的ZOI呈显著处理×时间交互，Day 1（24 h）S. aureus OD₆₀₀ 2.5组活性最高，选定该条件进入分离。

3.3 RT-qPCR：Day 1时DLP4在NaCl注射后即显著上调，细菌攻毒进一步数值升高但相对于NaCl对照无统计显著差异，说明DLP4为“注射相关广泛应答”而非严格病原特异；CLP1则于E. coli攻毒后上调、S. aureus攻毒下降低，呈效应子分化。

3.4–3.5 SPE分离与F3活性：Crude hemolymph经C18梯度得F1–F10，活性聚于F1–F4，F3对S. aureus抑制最强；SDS-PAGE示F3主带3.5–8 kDa，仍属异质肽混合物。

3.6 LC–MS/MS：F3检出保守N端基序ATCDLL（匹配DLP家族）、一例39 aa富半胱氨酸防御素样肽（ATCDLLSPFGVGHAACAVHCIAMGRRGGWCDDRAVCNCR）及CLP2等；合成DLP4给出完整40 aa序列ATCDLLSPFKVGHAACAAHCIARGKRGGWCDKRAVCNCRK（六Cys羧酰胺甲基化后中性质量4614.2082 Da，8+ m/z 577.78577，100%覆盖）。

3.7 MIC：DLP4对革兰氏阳性强效且菌株依赖——B. subtilis KCCM 11316为0.03–0.04 μM，L. ivanovii 0.1–0.2 μM，S. aureus各株0.44–2.12 μM，S. hyicus 0.9–1.1 μM；所试E. coli三株（KCCM 11234/CVCC 1515/ATCC 8739）至3.2 μM无MIC终点。

3.8 功能稳定性：以未处理ZOI=1.60 cm为100%，紫外30–90 min、4/?20/?80 ℃储存、37–100 ℃加热1 h后相对ZOI约85.4–97.9%；pH 2–11回调至7.4后仍保活；3–6% NaCl无碍；K⁺/Ca²⁺/Mg²⁺几乎无影响，Zn²⁺/Cu²⁺中度降活，Fe³⁺（5 mM）降至约64.6%。

3.9–3.13 序列与结构：SignalP定信号肽切于19–20，ProP定R56切出成熟40 aa（A57–K96），理论MW 4275.05 Da、pI 9.38、净正电+6、GRAVY略负；AMP Scanner与CAMP均判为AMP。AlphaFold2（pLDDT低中80余）与AlphaFold3预测紧凑α/β防御素样折叠，中央α-螺旋+β股+富Cys核；PPM 3.0示浅层外周膜结合、非跨膜插入；远紫外CD中水生混合构象，40 mM SDS与50% TFE下螺旋有序度升，乙酸与Tris/NaCl呈中间态。

讨论浓缩

血淋巴双菌均抑而纯DLP4仅抑革兰氏阳性，提示血淋巴抗E. coli归功cecropin/attacin/diptericin样协同；DLP4转录被NaCl注射即可诱导，故不能作病原特异标记，但S. aureus攻毒均值最高与其成熟肽表型自洽。MIC菌株差异归因于表面电荷、肽聚糖修饰、外排与胞外蛋白酶。F3异质混合物中防御素样+天蚕素样共存解释双谱活性。CD与建模共示环境依赖折叠及浅膜结合假设，非膜穿孔直接证据。Fe³⁺降活或涉氧化/配位扰动二硫键。研究整体将BSF诱导免疫与合成DLP4功能锚定，但未涉真实食品基质、毒理与感官，仅立“体外候选”地位。

结论译文

本研究整合细菌攻毒、血淋巴抗菌活性、基因表达、生物导向分离、LC–MS/MS与功能表征，探究亮斑扁角水虻抗菌应答及成熟DLP4属性。细菌攻毒引致处理与时间依赖的血淋巴活性变化，DLP4与CLP1差异化转录证明BSF免疫含多效应子。活性集中于C18-SPE早段，F3最高；LC–MS/MS检获DLP家族保守基序与富半胱氨酸防御素样肽，合成DLP4完整40 aa序列获确证。合成DLP4呈强而菌株依赖的革兰氏阳性活性（B. subtilis、L. ivanovii、Staphylococcus spp.），所试E. coli无MIC终点。DLP4于热、紫外、储存、pH、NaCl及多数金属离子下保留可测活性，Fe³⁺明显削弱。其阳离子富Cys序列、环境依赖构象、计算防御素样折叠及浅膜结合，共同构成互补分子语境。DLP4系理化稳健、主靶革兰氏阳性的抗菌候选，后续须在真实食品基质中评安全、机制、配方与加工相容性。