《Foods》：Behavior of Shiga Toxin-Producing Escherichia coli in Naturally Contaminated Bovine Raw Milk Cheese During Aging
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产志贺毒素大肠杆菌（STEC）是生乳乳制品中受关注的食源性病原体。确保产品安全需要定期开展内部自检，但关于天然污染STEC在成熟期间行为特征的证据仍有限。本研究分析了三批由STEC阳性凝乳生产的牛生乳洗皮奶酪，以评估：（I）STEC在奶酪轮内的分布情况，以及（
产志贺毒素大肠杆菌（STEC）是生乳乳制品中受关注的食源性病原体。确保产品安全需要定期开展内部自检，但关于天然污染STEC在成熟期间行为特征的证据仍有限。本研究分析了三批由STEC阳性凝乳生产的牛生乳洗皮奶酪，以评估：（I）STEC在奶酪轮内的分布情况，以及（II）STEC在成熟期间的行为变化。STEC检测依据ISO/TS 13136:2012进行。首先，对A批次中两个奶酪轮在三个时间点（生产后55、85和150天）分别于中心部位（n = 4）和外周部位（n = 4）进行采样。外周区域的检出率高于中心区域，但该模式并不一致，表明STEC分布存在异质性。其次，对B批次（n = 25）和C批次（n = 24）在四个时间点（生产后85–86、121–122、170–171和197–198天）进行采样。在B批次中，25个奶酪轮中有16个至少检测到一次阳性，并呈现阳性/阴性交替模式。在C批次中，没有奶酪轮始终为阴性，且在最终时间点仅有2/24个奶酪轮为阴性。这些发现突显了STEC在半熟牛生乳奶酪中的异质性分布及长达198天成熟期内持续可检出性，强调了在该类产品中进行STEC采样和检测所面临的挑战。
**论文解读：天然污染STEC在牛生乳洗皮奶酪中的分布与成熟期行为**
**1. 研究背景与目的**
生乳奶酪在加工过程中会形成复杂的微生物群落，这些微生物有助于牛奶酸化、凝乳形成和成熟，并最终决定产品的感官特性。然而，生乳本身或受污染的设备可能引入致病微生物，其中产志贺毒素大肠杆菌（STEC）是乳制品链中备受关注的病原体之一。STEC可携带stx1和stx2等毒力基因，并可通过eae基因编码黏附因子。人类感染STEC后通常引发腹泻，但5%–10%的病例可能进展为溶血性尿毒症综合征（HUS），且该病原体的感染剂量可低至1–700个活菌。反刍动物尤其是牛是STEC的主要储存宿主，人类感染主要通过食物途径传播。2024年，STEC感染在欧盟人类食源性疾病报告中位列第三，2023年六起强证据暴发中有五起与生乳产品有关。根据欧盟通用食品法，食品经营者（FBOs）必须确保产品安全，并实施微生物自检计划。然而，关于天然污染STEC在奶酪成熟期间行为的数据有限，且目前缺乏针对乳制品STEC采样的具体法规指导。因此，本研究旨在评估天然污染STEC菌株在牛生乳洗皮奶酪中的空间分布和时间变化，为FBOs的自检采样策略提供科学依据。
**2. 研究设计与方法**
研究人员于2023年1月至2月在意大利特伦托省一家乳品厂实施密集采样计划，对44个牛生乳凝乳进行STEC检测，其中8个呈阳性，随机选取3个阳性凝乳用于生产洗皮奶酪，并分别命名为A、B、C批次。A批次用于评估STEC在奶酪轮内的分布，B和C批次用于评估STEC在197–198天成熟期内的行为变化。奶酪采用凝乳酶凝固、凝乳在46±2°C下加热约30分钟，盐水浸泡2–4天，成熟初期用温热稀盐水擦拭表面。微生物检测依据ISO/TS 13136:2012，经缓冲蛋白胨水增菌后，采用实时荧光定量PCR（rtPCR）筛查stx1、stx2和eae基因，阳性增菌液再进行培养分离以确认活菌。同时检测水活度（aw）和pH值。样本来自商业化生产批次，B和C批次各25个奶酪轮（C批次后期因技术原因排除1个）。
**3. 研究结果**
**3.1 分布研究：奶酪轮内不同区域的分析**
A批次两个奶酪轮在55、85和150天三个时间点分别从核心和外周区域采样。结果表明，STEC在奶酪轮内分布不均。在T1A（55天）和T2A（85天）时，外周区域的检出率高于核心区域，例如在55天时，1号轮外周为100.0%，核心为75.0%；2号轮外周为75.0%，核心为50.0%。但在T3A（150天）时，1号轮仅一个外周样本阳性，核心无阳性；而2号轮核心检出率（75.0%）反而高于外周（50.0%）。这种不一致的模式表明STEC在自然污染的奶酪轮中呈现异质性分布。
**3.2 批次内分析：奶酪轮间的变异与成熟效应**
B批次在85–86、121–122、170–171和197–198天四个时间点检测，25个奶酪轮中有16个至少一次阳性，并出现阳性/阴性交替模式，部分初期阴性的奶酪轮在后续时间点转为阳性。C批次中，没有奶酪轮在所有时间点均为阴性，6个奶酪轮始终阳性，6个起初为疑似阳性的奶酪轮在后续转为培养确认阳性。至T4（197–198天），C批次仅2/24个奶酪轮为阴性。统计分析显示，B批次中T4的阳性/疑似阳性检出率显著高于T2（p=0.0455）；C批次中T4显著高于T1（p=0.0348）；且C批次在四个时间点的检出率均显著高于B批次。所有分离菌株均携带stx2基因，未检出欧洲前五大血清群和O104:H4血清型。
**4. 讨论与结论**
本研究表明，天然污染STEC在洗皮奶酪轮内及轮间分布不均，在长达198天的成熟后仍可检出，且呈现间歇性检出模式。单个奶酪轮的核心样本可能阴性，但同一奶酪轮的其他区域或后续时间点却阳性，提示单一采样点存在较高的假阴性风险。由于未对STEC进行定量和基因分型，不能认为成熟期后检出率上升代表细菌增殖，但表明长期成熟不能保证STEC完全消失。疑似阳性结果虽未能培养确认，但可能反映病原体浓度接近检测限，FBOs应采取谨慎态度。研究认为，凝乳阶段可能是更敏感的采样环节，因为凝乳能浓缩生乳中的细菌，早期发现阳性凝乳有助于及时采取控制措施。本研究基于商业化生产中的天然污染样本，较人工接种研究更能反映实际场景，但受限于样本量、未定量和未分型，结果外推需谨慎。结论强调，天然污染STEC在洗皮生乳奶酪中检测模式复杂，采样计划需考虑统计置信度，并建议修订欧盟法规，将STEC致病性评估扩展至当前有限血清群之外。FBOs应在整个生产链实施系统监测，以降低奶酪生产中的STEC风险。论文发表在《Foods》。
