靶向潜伏结核分枝杆菌：结核分枝杆菌休眠抗原作为疫苗候选的免疫原性评价

《International Journal of Molecular Sciences》：Targeting Latent Tuberculosis: Immunogenic Evaluation of a Mycobacterium tuberculosis Dormancy Antigen as a Vaccine Candidate

　　

据估计全球约21亿人感染结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis，Mtb）并面临活动性结核病（tuberculosis，TB）发生风险。由于Mtb以复制态与休眠态共存，有效疫苗须同时靶向两阶段抗原。研究人员评价了Mtb休眠抗原Rv2626c的免疫原性与疫苗潜力。利用流式细胞术与酶联免疫吸附试验（ELISA），在潜伏结核感染（latent TB infection，LTBI）、活动性TB及健康供者（healthy donors，HD）中分析细胞与体液免疫应答；采用覆盖Rv2626c序列的重叠肽及结构映射界定免疫显性区；并以表达Rv2626c的修饰牛痘病毒安卡拉（Modified Vaccinia Ankara，MVA）载体在小鼠攻击模型中评估保护效力。结果显示Rv2626c选择性诱导LTBI中CD4+IFN-γ+、SLAMF1+及多功能性T淋巴细胞频率升高，鉴定出跨蛋白序列的免疫显性肽段；MVA-Rv2626c免疫小鼠经Mtb H37Rv攻击后脾内菌负荷显著下降。综上，潜伏期相关抗原Rv2626c可在LTBI受试者激发免疫应答并限制小鼠感染模型细菌播散，有望与活跃期抗原联用构建抗Mtb感染的多阶段疫苗。

研究背景与立项依据

结核病由结核分枝杆菌（Mtb）引起，年新发近千万例，居单一病原致死首位。Mtb感染谱涵盖无症状免疫反应的潜伏感染（LTBI）至临床表现明确的活动性疾病，其中潜伏菌可在体内存活数十年后复燃。现行进入临床的候选疫苗多基于复制期抗原，难以阻断潜伏菌复燃。理想疫苗应兼顾复制期与休眠期抗原，而休眠期受DosR调控的缺氧响应蛋白1（Hypoxic Response Protein 1，HRP1，即Rv2626c）因在LTBI中引发强IFN-γ应答而被视为多阶段疫苗（multistage vaccine）候选。研究人员此前已证实Rv2626c可区分已建立LTBI与近期暴露者，本研究进一步在细胞多功能水平、单肽精度、三维结构映射及体内MVA载体保护效力上系统评估其免疫原性，论文发表于《International Journal of Molecular Sciences》。

主要关键技术方法

研究纳入阿根廷布宜诺斯艾利斯Dr. F. J. Mu?iz医院招募的成人队列：经QuantiFERON-TB Gold In-Tube（QFT-GIT）判定的LTBI、培养确诊且抗TB治疗少于一周的活动性TB患者、以及QFT阴性且无非结核暴露史的健康供者（HD），所有人均曾接种卡介苗（BCG）。人源实验采用36条覆盖全长的13–15 mer重叠合成肽（GenScript合成）、重组Rv2626c蛋白、流式细胞术（胞内IFN-γ/TNF-α/IL-2及表面SLAMF1/CD150、PD-1/CD279染色）、ELISA定量上清IFN-γ与血浆抗肽IgG；结构映射以AlphaFold v3补全PDB 1Y5H缺失残基后用YASARA可视化。动物实验采用雌性BALB/c小鼠，舌下接种两剂MVA-Rv2626c（或PBS对照、皮下BCG对照），终免4周后气管内H37Rv（1×10⁴ CFU）攻击，4周后取肺脾均质计CFU。

研究结果

2.1 Rv2626c诱导LTBI个体强抗原特异性CD4⁺ T细胞应答

PBMC经重组Rv2626c刺激5天，流式显示LTBI组IFN-γ⁺CD4⁺ T细胞频率显著高于TB与HD；LTBI淋巴细胞SLAMF1（CD150）表达上调而PD-1无组间差异；LTBI中IFN-γ⁺TNF-α⁺IL-2⁺三阳性多功CD4⁺ T细胞频率远高于其余两组，表明该休眠抗原在LTBI中激发高质量Th1型细胞免疫。

2.2 细胞与体液免疫相关的Rv2626c免疫显性区鉴定

以36条重叠肽刺激LTBI PBMC，33条均值超18 pg/mL操作阈值（等价于0.45 IU/mL，既往Rv2626c-IGRA切点）；综合应答幅度与应答者比例，肽2、5、10、11及21–24区、28、30定为细胞免疫显性；同批LTBI血浆抗肽IgG筛选得肽16、18、19、20、22、26、36为体液显性。既往NetMHCII预测提示显性肽具广覆盖HLA-II人群潜力。

2.3 Rv2626c免疫区域的 structural mapping

将IFN-γ相关肽（浅绿）与IgG相关肽（青）投至AlphaFold模型：细胞表位分布于中央β链及1–20、60–86非规则区，不含C端α螺旋；抗体表位覆盖α3与C端α5及60–86暴露环，中央β链仅一条入选；两集重叠23%（33/143残基），肽22（SIYYVDANASIQEML）兼获细胞与体液识别，为双识别热点。

2.4 MVA-Rv2626c接种降低Mtb攻击后细菌播散

小鼠舌下MVA-Rv2626c两剂，终免30天H37Rv气管攻击，再30天计CFU。肺荷与PBS组无差，但脾荷较PBS显著下降（p<0.01），接近BCG组水平；疫苗组脾源Rv2626c特异性CD4⁺IFN-γ⁺频率与IFN-γ量高于PBS（p<0.0001）。提示该抗原虽未在小鼠肺缺氧环境显效，但可抑淋巴造血播散。

讨论与结论翻译

讨论指出，LTBI控制依赖CMI，Rv2626c在LTBI选择性唤活SLAMF1⁺及三细胞因子阳性CD4⁺ T细胞，肽22在人鼠保守（小鼠H-2K^d表位IYYVDANASI位于其内）；MVA载体本身未加佐剂，肺无保护可能因小鼠肺肉芽肿缺氧不足致Rv2626c不表达，而脾部保护反映对淋巴播散相的识别。结论：本研究在LTBI中精细刻画Rv2626c细胞/体液免疫显性肽及其结构分布，并借MVA-Rv2626c在小鼠模型获脾脏菌荷降低的初步体内支持，拓展对该休眠抗原免疫识别的认知，凸显其与复制期抗原组合入多阶段TB疫苗的价值。