从哺乳动物细胞到极端微生物的荧光显微镜用de novo泛罗丹明结合蛋白

《Cell》：De novo pan-rhodamine binders for fluorescence microscopy from mammalian cells to extremophiles

　　

摘要翻译：
荧光成像是生命科学的基石。虽然天然荧光蛋白已被工程改造以增强单一特性，但现有标签中没有任何一种能将理想特性整合到一个系统中：高亮度、可逆结合、紧凑尺寸以及在多种条件下的稳定性。在此，研究人员通过de novo设计罗丹明结合蛋白（Rhobin）实现了这一目标。为了利用广泛的罗丹明荧光团库，研究人员开发了一种适用于多种波长和应用的泛罗丹明结合蛋白（pan-rhodamine binder）通用设计策略。Rhobin能够对哺乳动物细胞中多种亚细胞靶标进行活细胞和固定细胞成像，其亮度超越现有标签。其可逆荧光团结合支持超分辨受激发射损耗（STED）显微镜以及相较于HaloTag更长时程的活细胞单分子成像。超越常规系统，Rhobin还能够在75°C下对极端微生物Sulfolobus acidocaldarius进行活体成像，这是现有标签此前无法实现的。综上所述，这些结果确立了Rhobin作为下一代成像和生物传感器设计的通用平台。

论文解读

**研究背景与科学问题**

荧光成像技术是现代生命科学研究的基石，而荧光标记工具的开发是其中至关重要的环节。长期以来，科学家们主要依赖两大类标记系统：一类是天然荧光蛋白（FPs）及其工程化变体，另一类是基于酶自标记的标签如HaloTag和SNAP-tag。尽管这些工具被广泛使用，但它们各自存在固有的局限性。天然荧光蛋白虽然在活细胞成像中被广泛使用，但通常存在成熟时间慢、光谱范围有限以及光稳定性不足等问题；基于酶共价结合的标签系统虽然信号牢固，但其不可逆结合特性限制了在长时间、高强度成像（如超分辨显微术和单分子成像）中的应用。更为关键的是，这些基于天然蛋白改造的工具通常不具备足够的稳定性，无法应用于生活在极端环境中的生物体，例如在75°C和pH 2条件下生长的嗜热古菌。此外，任何单一现有标签都难以同时满足高亮度、可逆结合、小尺寸、热稳定性以及与现有标签的正交性等多重理想特性。正是在这一背景下，研究人员尝试利用de novo蛋白设计策略，从第一性原理出发，构建一个全新的、集多种优势特性于一体的荧光标签，以满足从哺乳动物细胞到极端微生物的广泛应用需求。

**研究内容与总体结论**

研究人员开发了一种计算设计策略，成功设计出一类全新的泛罗丹明结合蛋白，命名为Rhobin（Rhodamine binder）。该蛋白通过识别罗丹明染料的荧光两性离子形式中的极性羧基苯基和呫吨核心，同时容忍染料其他位置的不同取代基，从而实现对多种罗丹明衍生物的高亲和力结合。其中性能最优的Rhobin9对目标染料Janelia Fluor 660（JF660）的解离常数（KD）低至91 nM，并能以纳摩尔级亲和力结合多种不同光谱特性和K_L-Z值的罗丹明衍生物。晶体结构验证了设计模型的准确性，确认了设计策略的成功。在细胞应用中，Rhobin表现出优于现有标签的亮度和光稳定性，支持活细胞和固定细胞的多靶标成像、超分辨STED成像以及长时间单分子追踪。尤为重要的是，Rhobin表现出超强的热稳定性，其熔解温度（Tm）超过95°C，成功实现了在75°C下对活体嗜热古菌Sulfolobus acidocaldarius的蛋白质特异性荧光成像。该研究发表于《Cell》。

**主要技术方法**

本研究的核心方法是计算蛋白设计。研究人员首先使用基于扩散模型（RFdiffusion）的方法生成定制化蛋白骨架，并在设计中引入精氨酸-羧基相互作用基序来识别罗丹明的极性羧基，利用虚拟扩张的罗丹明模板确保结合口袋的通用性。随后使用LigandMPNN和Rosetta FastRelax进行序列设计，并通过RaptorX-Single进行结构预测过滤。实验验证方面，研究采用大肠杆菌表达纯化、荧光滴定测定结合常数、圆二色光谱（CD）表征蛋白稳定性、X射线晶体学解析蛋白结构。细胞实验使用U2OS细胞系（购自ATCC）作为哺乳动物细胞模型，并通过Pa01整合酶系统建立稳定细胞系；极端微生物实验使用Sulfolobus acidocaldarius MW001菌株。单分子成像和STED成像分别在近全内反射荧光（TIRF）显微镜和STEDYCON模块上进行。

**研究结果**

**De novo design of Rhobins（Rhobins的从头设计）**
研究人员受G蛋白偶联受体（GPCRs）识别配体机制的启发，采用双部分方案：利用模板化扩散探索结构可变的结合亚结构域以容纳罗丹明配体，同时连接一个紧密堆积的螺旋束亚结构域以保证稳定性。设计目标选择远红光发射的碳罗丹明JF660，并最终筛选出9个设计序列（Rhobin1–Rhobin9），其分子量约17 kDa，显著小于HaloTag7。

**Rhobins as pan-rhodamine binders with nanomolar affinities（Rhobin作为纳摩尔亲和力的泛罗丹明结合蛋白）**
9个Rhobin中有8个在体外能结合JF660，其中Rhobin9亲和力最高（KD=91 nM）。Rhobin9对不同K_L-Z值的罗丹明衍生物均表现出纳摩尔级亲和力：包括高K值染料罗丹明101（KD=109 nM）、JF503（KD=325 nM），中等K值的SiRhP（KD=573 nM）和JF669（KD=113 nM），以及低K值的强荧光原性染料JF646（KD=119 nM）和JFX646（KD=201 nM）。除JF503外，Rhobin9结合使染料荧光增强2至11倍。晶体结构显示，设计模型与实测结构高度一致（Cα RMSD<0.7 ?），Rh101的结合姿势与设计完全吻合（0.6 ? RMSD）。

**Benchmarking of Rhobin in mammalian cells（Rhobin在哺乳动物细胞中的性能基准测试）**
研究人员开发了一种基于H2B融合蛋白和双荧光标记物的定量筛选方法，通过mNeonGreen作为表达水平内参，mTagBFP作为分割标记，计算表达归一化亮度。在U2OS细胞中，Rhobin9与JF660的组合产生的归一化亮度是染料背景的229倍，显著优于HaloTag7和reHaloF系统。不同Rhobin变体对硅罗丹明（Si-rhodamine）类染料表现出不同的选择性谱：Rhobin9为广谱结合和荧光激活剂，而Rhobin2、Rhobin3和Rhobin6对特定染料如SiRhP和JFX650表现出更强的选择性。

**Cellular microscopy using Rhobin（利用Rhobin进行细胞显微成像）**
通过将Rhobin2融合到多种亚细胞定位蛋白上，在U2OS稳定细胞系中成功实现了细胞核、核仁、核纤层、肌动蛋白丝、内体、网格蛋白包被小窝、内质网、高尔基体和线粒体外膜等多种亚细胞结构的活细胞和固定细胞成像。标记动力学测试显示Rhobin2与SiRhP的结合半衰期（t_1/2）为3.8 ± 0.7分钟。在三色复用成像中，Rhobin2与SNAP-tag和HaloTag7系统展现出良好的正交性，可实现线粒体、内质网和细胞核的同时标记和成像。

**Advanced fluorescence microscopy using Rhobin（利用Rhobin进行先进荧光显微成像）**
Rhobin的可逆染料结合特性使其在光漂白后能通过溶液中游离染料的快速交换实现信号恢复，从而显著延长成像时程。在STED超分辨成像中，Rhobin2/SiRhP成功解析了线粒体外膜（分辨率优于100 nm）和内质网管状网络结构，并在150个时间点的延时时程成像中表现出最低的光漂白率，优于HaloTag7和reHaloF。在单分子成像应用中，利用近TIRF照明和5 nM SiRhP实现了对ER上SEC61B蛋白的单分子追踪，定位精度达到16.6 ± 7.2 nm。虽然单分子亮点的寿命受光漂白影响而短于固有解离半衰期（8.6 s），但由于溶液中大量游离染料的补充，可以在10,000帧（约3.5分钟）的长时间采集内持续获得可追踪的分子，而共价标记的HaloTag7在40秒内几乎检测不到任何定位信号。通过frame-pair距离分布分析，研究人员获得了与HaloTag7一致的SEC61B扩散行为数据，显示出近不动和沿ER管一维扩散（D≈0.19 μm2/s）两种成分。

**Protein-specific labeling in extremophiles（极端微生物中的蛋白质特异性标记）**
圆二色光谱实验证实8个Rhobin变体的Tm均超过95°C，而HaloTag7的Tm低于75°C。在75°C下，Rhobin9与JF660的相互作用依然保持稳定（通过诱导圆二色信号证实），而HaloTag7与Halo-JF660的相互作用则完全丧失。研究人员将Rhobin9融合到嗜热古菌Sulfolobus acidocaldarius的S层蛋白SlaB和核仁相关蛋白Cren7上，在75°C和pH 2的培养条件下实现了对这两种蛋白的特异性活细胞荧光标记，并首次通过荧光标记蛋白观察到了染色体分离和细胞分裂的时间动态过程。

**总结与讨论**

该研究的核心贡献在于证明了一种将多种理想功能特性转化为结构约束并整合到单一de novo蛋白设计流程中的可行性。通过不到12个测试序列，即可获得性能比肩甚至超越经过多年迭代工程改造的天然蛋白标签的设计蛋白。Rhobin具有七大优势：与广谱罗丹明兼容、分子尺寸小（17 kDa）、细胞亮度高、可逆结合具有调节弹性、极端热稳定性、成本低廉以及设计流程可扩展到其他荧光团。该研究表明de novo蛋白设计已超越概念验证阶段，能够预先设定并实现全面的高性能特征组合，为下一代生物工具的理性设计开辟了新途径。研究也存在局限性：罗丹明染料本身对某些亚细胞结构存在弱非特异性结合，且尽管Rhobin小于HaloTag系统，但对其融合蛋白潜在的结构功能扰动也不能完全排除。