Bacteroides cellulosilyticus来源的2-羟基苯乙酸通过靶向PPARγ-CD36轴纠正MASLD中的肝脏脂质稳态

《Gut Microbes》：Bacteroides cellulosilyticus-derived 2-hydroxyphenylacetic acid rectifies hepatic lipid homeostasis in MASLD by targeting the PPARγ-CD36 axis

　　

摘要：肠道微生物群在代谢功能障碍相关脂肪性肝病（MASLD）的发生和发展中发挥重要作用，但所涉及的具体分子机制尚未完全阐明。本研究通过人群队列研究发现，MASLD患者中Bacteroides cellulosilyticus（B. cellulosilyticus）的相对丰度显著降低。通过整合宏基因组学与代谢组学分析，研究人员证实B. cellulosilyticus及其代谢产物2-羟基苯乙酸（2HPAA）是调控MASLD发生发展的关键因素。单细胞测序与脂质组学分析揭示，2HPAA可通过肠肝循环进入肝脏发挥调控作用。具体而言，2HPAA抑制过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARγ）信号通路，进而抑制脂肪酸转运体CD36的表达。同时，2HPAA通过显著增强棕榈酸转化效率并抑制CD36棕榈酰化来调节肝细胞脂质代谢。这种对CD36表达和棕榈酰化的双重调控作用可减少肝细胞脂质蓄积，最终缓解MASLD进展。上述发现揭示了B. cellulosilyticus和2HPAA通过靶向PPARγ-CD36通路缓解MASLD的机制，为研究肠道微生物群-宿主相互作用调控肝脏疾病提供了新视角。

《Gut Microbes》论文解读：Bacteroides cellulosilyticus来源的2-羟基苯乙酸通过PPARγ-CD36轴纠正MASLD肝脏脂质稳态

一、研究背景与科学问题

代谢功能障碍相关脂肪性肝病（MASLD）已成为全球最常见的慢性肝病，影响约38%的成年人，其疾病谱涵盖肝脂肪变性、代谢功能障碍相关脂肪性肝炎（MASH）、肝纤维化、肝硬化乃至MASLD相关肝细胞癌（MASLD-HCC）。MASLD常与胰岛素抵抗（IR）、2型糖尿病（T2DM）和心血管疾病（CVD）等代谢紊乱共存，增加不良临床结局风险。然而，MASLD发病和进展的复杂病因及病理因素尚未完全阐明，且目前尚无获得国际批准的抗MASLD药物。肠道微生物群及其代谢产物在MASLD发病中具有关键作用，特定致病菌可通过驱动肝脏从头脂肪生成、促进炎症和加速脂肪肝形成而参与MASLD进展。但尽管肠道菌群失调是MASLD患者的普遍特征，特定微生物种类和代谢产物相关的功能机制及宿主反应仍缺乏充分表征。

在肠道微生物生态系统中，Bacteroides属是共生菌群的主要组成部分，在复杂膳食碳水化合物的发酵中发挥关键作用。其中，Bacteroides cellulosilyticus（B. cellulosilyticus）以其卓越的代谢专一性著称，编码大量碳水化合物活性酶（CAZymes）和多糖利用位点，水解纤维素、木聚糖和果胶等多种复杂多糖的能力超过大多数已知肠道共生菌。尽管具有广泛的酶学能力，B. cellulosilyticus在MASLD中潜在益生菌作用及其影响肝脏稳态的机制仍有待阐明。

肠肝轴是连接肠道和肝脏的关键双向通路，肠道微生物来源的代谢产物作为关键信号分子调节肝脏稳态和炎症反应。芳香族氨基酸衍生物是能够穿过肠道屏障作用于宿主核受体或代谢传感器的重要信号分子，从而调节远端器官的免疫和代谢稳态。已有研究表明酪氨酸代谢产物如4-羟基苯乙酸（4HPAA）和3-羟基苯乙酸（3HPAA）可通过激活SIRT1信号通路或下调肝脏组蛋白乙酰化水平逆转肝脂肪变性。然而，苯丙氨酸衍生物2-羟基苯乙酸（2HPAA）在抗MASLD中的作用和机制仍不清楚。基于此，研究人员开展了本研究，旨在鉴定B. cellulosilyticus及其代谢产物2HPAA在MASLD中的功能作用及分子机制。

二、主要关键技术方法

研究人员利用curatedMetagenomicData公共数据库中的2,800例高质量人类粪便宏基因组样本（1,631例健康对照和1,169例超重个体）作为发现队列，结合VIP评分和共现网络分析鉴定关键菌种；通过非靶向代谢组学、靶向代谢组学、脂质组学、单细胞RNA测序（scRNA-seq）、宏基因组测序、多重免疫荧光染色、酰基-聚乙二醇交换实验（APE assay）以及分子对接等技术手段，在小鼠模型和HepG2细胞系中开展体内外功能验证。此外，研究人员构建了aroB基因敲除的B. cellulosilyticus突变株（B. c ?aroB）以确证因果关系，并利用PPARγ激动剂罗格列酮进行回补实验。人群队列验证部分纳入了85例受试者（26例健康对照、29例轻度MASLD和30例中重度MASLD患者）进行血清2HPAA靶向检测。动物实验经青岛大学医学院伦理委员会批准，小鼠为6周龄雄性C57BL/6J小鼠，采用高脂饮食（HFD）诱导MASLD模型。

三、研究结果

（一）B. cellulosilyticus在MASLD患者中缺乏

通过大规模人类队列分析，VIP和共现网络分析表明Bacteroides是突出的差异菌属，在微生物生态网络中占据核心拓扑位置。进一步的Bacteroides属内共现网络分析鉴定出B. cellulosilyticus为关键菌种，在超重个体中相对丰度显著降低。在具有生化代谢数据的受试者中，B. cellulosilyticus丰度与血清TG水平和血清AST活性显著负相关，与HDL-C水平显著正相关。在两个独立临床队列中，研究人员证实MASLD和肝硬化患者中该菌丰度一致降低，T2D和IGT患者中也同样减少。这些大队列观察为B. cellulosilyticus缺乏可能与MASLD相关代谢紊乱有关提供了生态学线索。

（二）B. cellulosilyticus补充可缓解小鼠MASLD

研究人员在HFD诱导的MASLD小鼠模型中进行B. cellulosilyticus AF17-25补充干预。8周后，该菌成功定植，小鼠体重显著降低，且与膳食热量摄入差异无关。补充B. cellulosilyticus减少了附睾脂肪质量、空腹血糖、空腹胰岛素和HOMA-IR指数，表明胰岛素敏感性改善；同时降低了肝重。肝脏H&E和油红O染色显示脂滴积累减少、组织形态改善、肝脂肪变性缓解。生化分析显示肝组织TG、TC和AST水平显著降低，血清TC和TG水平降低，HDL-C升高而LDL-C降低。表明补充B. cellulosilyticus可改善胰岛素敏感性、缓解肝脂肪变性并调节脂质代谢，发挥抗MASLD保护作用。

（三）2HPAA是介导B. cellulosilyticus作用的关键代谢产物

对MASLD小鼠模型的粪便、肝脏和门静脉样本进行代谢组学分析。OPLS-DA和差异分析显示B. cellulosilyticus处理显著重塑了粪便代谢谱。KEGG通路富集分析表明苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成以及苯丙氨酸代谢是最显著富集的通路。芳香族氨基酸代谢产物中2HPAA表现出差异丰度。五种候选代谢产物的中介分析确定2HPAA是连接肠道微生物群与TC、TG等生化表型的关键效应分子。靶向检测显示B. cellulosilyticus处理后粪便、门静脉和肝脏中2HPAA浓度均显著升高。

（四）外源性补充2HPAA可缓解小鼠MASLD

基于剂量反应评估确定150 mg/kg为最佳治疗剂量后，研究人员进行动物实验并结合肝脏转录组学和脂质组学分析。外源性2HPAA补充改变了体重动态、降低了体重增加且不影响能量摄入，减少了附睾脂肪重量，改善了全身代谢状态：空腹血糖、胰岛素水平和HOMA-IR指数均降低。2HPAA还降低了肝重，组织学分析显示HFD诱导的肝脂肪变性和脂滴积累显著缓解，MASLD评分降低，油红O阳性脂质面积减少。生化检测证实2HPAA降低了肝组织TC、TG、ALT和AST水平，并正常化了血清脂质谱。转录组分析显示差异表达基因显著富集于脂质相关生物学过程，RT-PCR证实脂肪酸氧化基因Cpt1a显著上调，而脂质运输和脂肪生成相关基因包括Mttp、Pparg2、Apob和Cd36显著下调。脂质组学显示B. cellulosilyticus干预显著减少肝脏甘油三酯积累，表明2HPAA的核心保护作用在于维持肝脏脂质稳态。

（五）2HPAA与B. cellulosilyticus抗MASLD的因果作用

全基因组分析显示B. cellulosilyticus具有强大的碳水化合物代谢系统，为莽草酸途径合成苯丙氨酸提供初始底物。靶向氨基酸检测证实B. cellulosilyticus补充显著增加苯丙氨酸含量，苯丙氨酸是下游2HPAA产生的前体。在莽草酸途径中，由aroB基因编码的3-脱氢奎尼酸合酶是关键限速酶。研究人员构建了aroB基因敲除的B. cellulosilyticus突变株（B. c ?aroB），该基因敲除不影响细菌生长。在HFD诱导的MASLD动物模型中，B. c ?aroB丧失了减重效应，但补充2HPAA可恢复该效应。B. c ?aroB组小鼠肝脏和白色脂肪组织重量升高、空腹血糖升高且葡萄糖耐量受损，2HPAA可逆转这些变化。H&E评分和油红O染色定量证实B. c ?aroB处理小鼠肝脂肪变性加重，而2HPAA补充可改善。靶向代谢组学显示aroB缺失消除了粪便苯丙氨酸和2HPAA的过量产生，门静脉和肝脏中2HPAA水平同步降低，进一步支持B. cellulosilyticus来源的2HPAA可被吸收入门脉循环并输送至肝脏发挥抗MASLD作用。

（六）2HPAA通过抑制肝脏PPARγ信号通路缓解MASLD

对肝脏组织进行单细胞转录组测序，经严格质控获得89,135个高质量细胞，聚类为13个亚群并注释为8种主要细胞类型，包括肝细胞、肝星状细胞、Kupffer细胞、肝窦内皮细胞、T细胞、树突状细胞、胆管细胞和B细胞。研究人员聚焦于肝细胞，获得57,503个高质量肝细胞，利用肝脏分区标记基因重新聚类揭示三个空间亚群（Zone 1-3）和一个干扰素刺激基因（ISG）高表达亚群。分区肝细胞差异表达分析在Zone 1、2、3中分别鉴定出927、1,480和842个差异表达基因。功能富集分析显示PPAR信号通路在Zone 3（中央静脉周围）显著富集。中央静脉周围肝细胞是从头脂肪生成的低氧核心和MASLD的主要部位。分析Ppara、Ppard和Pparg在分区肝细胞中的表达发现，2HPAA显著下调Zone 3中的Pparg。组织水平的免疫荧光和western blot证实2HPAA处理显著降低肝脏PPARγ蛋白表达。分子对接提示2HPAA与PPARγ之间存在理论上的非共价结合模式，但仍需进一步实验验证。

（七）PPARγ抑制减少CD36棕榈酰化

研究人员在单细胞水平进行计算机模拟基因敲除和扰动分析。基于显著性标准（Z-score > 1.645, p < 0.05），在Zone 1-3中分别鉴定出48、408和447个扰动基因。Zone 3特异性扰动基因富集于脂质代谢、摄取和转运通路，其中外源脂肪酸转运体Cd36是关键枢纽基因。Pparg缺失诱导的Cd36扰动在Zone 3中最显著，联合密度分析证实该区存在明显的Pparg+/Cd36+细胞群，表明PPARγ活性与CD36介导的脂肪酸摄取紧密偶联。实验验证显示2HPAA处理显著降低PPARγ/CD36蛋白水平，4重免疫荧光染色显示CD36和PPARγ荧光强度显著降低，表明肝细胞中PPARγ/CD36表达被特异性抑制。在HepG2细胞中，脂滴染色显示模型组大量聚集而2HPAA处理缓解。mRNA和蛋白水平上CD36和PPARγ表达均被2HPAA降低。对肝脏组织和细胞系进行的PEG标记棕榈酰化实验显示，2HPAA降低CD36棕榈酰化水平、抑制PPARγ，随后减少脂肪酸摄取并恢复脂质稳态。

（八）2HPAA通过抑制PPARγ减少肝脏脂质积累

脂质代谢组学评估了2HPAA对HepG2细胞系和肝脏组织脂质稳态的有益作用。2HPAA处理显著重塑了整体脂质组成，总TG积累和特定高VIP TG种类显著减少，而PC的比例和丰度增加。研究人员通过12周HFD喂养动物实验使用PPARγ激动剂罗格列酮证实了PPARγ在2HPAA介导的MASLD缓解中的关键作用。罗格列酮处理组显著增加体重增加、肝重和附睾脂肪重量，逆转了2HPAA对肝脂肪变性的改善，升高了MASLD评分和油红O阳性面积。整体脂质组成分析证实2HPAA诱导的有利脂质谱在罗格列酮组被逆转，总TG积累显著增加而总PC水平下降。结果表明罗格列酮削弱了2HPAA对PPARγ的抑制作用，从而损害了2HPAA调节脂质稳态的能力。

（九）2HPAA与MASLD进展的人群队列验证

为探索2HPAA与MASLD的临床相关性，研究人员收集了健康个体和不同程度MASLD患者的血清样本进行代谢组学分析。非靶向和靶向代谢组学结果均表明，随着MASLD严重程度增加，血清2HPAA含量呈显著下降趋势。相关性分析显示血清2HPAA水平与BMI、肝损伤指标（ALT、AST和GGT）及代谢紊乱指标（TG、尿酸）显著负相关。此外，纵向队列研究显示42名志愿者在30天密闭航行后B. cellulosilyticus相对丰度显著降低。长期密闭环境中的多重压力破坏肠道微生物稳态，尤其威胁依赖纤维的共生菌如B. cellulosilyticus的生存，保护性细菌的丧失可能使个体易患与肝脂肪变性相关的代谢异常。研究人员指出，目前MASLD患者血清2HPAA降低代表观察性关联，尚不能确定因果关系或直接治疗相关性，需进一步的纵向和机制研究。

四、讨论与结论

本研究发现B. cellulosilyticus来源的2HPAA是介导肠肝对话的关键介质，通过抑制PPARγ对CD36表达和棕榈酰化进行双重调节，从而缓解MASLD。该研究建立了B. cellulosilyticus与2HPAA抗MASLD效应的明确因果关系，与Parabacteroides goldsteinii来源的异丁酸、Butyricimonas virosa来源的硫胺素以及Alistipes indistinctus来源的马尿酸等研究共同支持了“微生物-代谢物-靶点”模式在代谢疾病中的普遍性。

机制上，2HPAA通过直接抑制PPARγ/CD36信号通路发挥肝脏保护作用，单细胞测序和分子对接分析表明2HPAA可与PPARγ的关键氨基酸残基（Tyr327、Cys285、His323和Ser289）结合，作为潜在PPARγ抑制剂抑制CD36表达。同时，2HPAA降低CD36棕榈酰化，这种翻译后修饰对CD36膜定位和脂肪酸转运活性至关重要。这种对CD36的双重调控在转录水平和翻译后水平有效抑制肝细胞脂质摄取和积累。脂质组学分析进一步揭示2HPAA增强棕榈酸转化效率，提示其除抑制脂质摄取外还促进脂质分解，2HPAA上调脂解相关基因并下调脂质运输相关基因，表明其双向调节脂质代谢。

临床转化方面，循环2HPAA水平与临床常规检测指标（BMI、AST、ALT、GGT和尿酸）的负相关为2HPAA作为新型候选代谢标志物或治疗药物提供了支持。但研究人员强调，目前发现主要支持其生物学作用及与MASLD表型的关联，而非确立其作为明确的诊断或预后生物标志物，未来需在独立临床队列中进行严格验证。研究局限性包括公共宏基因组数据集缺乏详细临床元数据、缺乏肝脏组织学细节和特定肝硬化病因，以及缺乏膳食元数据。未来研究需纳入经活检证实的MASLD临床队列并全面追踪饮食。此外，补充B. cellulosilyticus或外源性2HPAA可能成为有前景的微生物群干预策略，而将保护性菌株补充与病原菌抑制相结合的联合方案可能产生协同综合治疗效果。

结论：本研究鉴定出B. cellulosilyticus来源的2HPAA是肠肝对话的关键介质，通过抑制PPARγ对CD36表达和棕榈酰化进行双重调节从而缓解MASLD。这些发现揭示了肠道微生物群调节肝脏脂质代谢的新机制，为开发MASLD靶向治疗提供了新见解。通过增强B. cellulosilyticus定植、内源性补充2HPAA或靶向PPARγ/CD36轴，可能为这种常见代谢性肝病的预防和治疗提供有前景的策略。该研究发表在《Gut Microbes》期刊上。