《Cancers》：Interpreting Mutation Co-Occurrence in Cancer Genomics Under Biological Context
简单总结：癌症通过使细胞群体生长、存活和演化的遗传改变而发展。在癌症基因组研究中，当突变被同时检测到时被描述为共现，但这种模式并不能证明生物学上的协同作用。当具有不同临床或分子特征的肿瘤被合并分析时，关联可能发生变化，并且批量标本无法显示突变是否发生在同一区域、克隆或细胞中。本综述从临床背景、肿瘤演化、空间异质性和单细胞组成等方面审视突变共现。一个假设的数值例子表明，合并具有不同突变患病率的肿瘤可以逆转关联的表观方向。我们还总结了统计检验、克隆推断、单细胞解释和功能验证的方法。综述强调，统计关联、物理定位和功能相互作用是需要不同证据的不同问题。
摘要：癌症基因组中观察到的体细胞突变模式被广泛用于生成关于癌症基因和信号通路之间功能关系的假设。然而，突变共现和互斥性在多个层面进行评估，包括队列、批量标本、病灶、区域、克隆和单个细胞，尽管每个观察层面支持不同范围的推断。在这篇结构化叙述性综述中，我们阐明了这些推断边界，并区分了边缘关联与条件关联，以及负关联与完全互斥性。一个假设的辛普森逆转数值例子说明了边缘关联和条件关联可能不同，以及为什么具有非零重叠的负关联应与完全互斥性区分。然后，我们综合来自批量、多区域、系统发育和单细胞分析的证据，以检验空间和克隆定位、克隆间协同、单细胞错误和检测能力，以及遗传与非遗传耐药性。我们还提供了方法选择的决策指南和功能验证的分阶段框架。总体而言，统计关联、物理定位和功能相互作用是相关但不同的推断目标，需要不同的数据、假设和验证形式。
1. 引言
癌症基因组学为理解恶性肿瘤内多样化细胞群体竞争和适应的演化过程提供了重要的生物学见解。癌症起始和进展的核心过程是通过赋予细胞选择性优势的突变的顺序积累而发生的。已知这一癌症演化过程涉及12条主要信号通路和140个调控细胞命运、细胞存活和基因组维护的核心基因[1]。此外，获得选择性演化优势的克隆群体的扩增，连同肿瘤内异质性(ITH)，构成了驱动癌症演化的关键机制[2]。在这一演化框架内，跨肿瘤基因组观察到的突变模式已成为阐明癌症相关基因与信号通路之间功能关系的重要线索。
突变共现和互斥性描述了癌症中改变之间关系的广泛研究模式。在队列分辨率下，共现表示在指定零模型下独立肿瘤之间的正关联，而互斥性表示双阳性肿瘤的缺失；负关联可包括非零重叠。完全互斥性是描述性条件，即不存在双阳性观察单元。这些统计模式可以激发关于协同、功能冗余、谱系限制或合成致死的假设，但没有一种机制能仅从模式中推断出来[3,4,5,6,7]。当临床或生物学异质性层被合并时，边缘关联可能与层特异性或协变量调整后的关联不同。这种聚合问题必须与标本内区域、亚克隆或细胞的混合物区分开。
现有综述已经确立了亚克隆重建、分支演化、多区域测序和计算互斥性分析的原理[5,8,9,10]。在此基础上，本综述解决了一个不同的实际问题：如何将关于突变共现的生物学主张与观察单元、统计假设和支持该主张所需的证据对齐。为解决这一问题，我们形式化了聚合问题，用假设的数值例子说明其后果，为将分析方法与推断问题匹配提供实用指导，并概述功能验证的分阶段框架。因此，本综述在三个生物学分辨率层面审视突变共现。在队列层面，关联必须根据肿瘤突变负荷(TMB)、分子亚型和队列组成的变异来解释。在克隆层面，肿瘤内共检测应在克隆结构、亚克隆分支、空间分布和系统发育谱系的背景下解释。在单细胞层面，数据可以评估共检测突变是否在同一个测量的细胞中观察到、是否分离在不同细胞群体中、或是否局限于稀有细胞群体，但受可调用性、错误和采样限制的影响。综合起来，这些层面定义了一个从队列到克隆再到细胞的框架，同时区分三个相互关联的推断问题：观察单元之间的统计依赖性、患者或肿瘤内的物理定位，以及细胞群体内部或之间的功能相互作用。
我们进行了结构化叙述性综述。PubMed/MEDLINE和Europe PMC从建库至2026年8月3日进行了检索。检索将癌症或肿瘤术语与突变共现、互斥性、遗传相互作用、上位效应、混杂、分子亚型、ITH、变异等位基因频率(VAF)、癌细胞分数(CCF)、系统发育、多区域测序、单细胞DNA测序(scDNA-seq)、克隆间协同、循环肿瘤DNA、药物耐受状态和获得性耐药等术语结合。确切的数据库特定查询和检索日期返回的记录在附录A(表A1)中重现。预印本在提供相关方法学发展时被纳入，但不作为明确生物学结论的主要证据。符合条件的文章引入或基准测试了相关方法、分析了人类癌症基因组数据、建立了测量限制或实验测试了机制解释。由于检索设计用于批判性叙述综合而非详尽枚举，研究根据与本综述推断框架的直接相关性、方法学严谨性、证据水平和说明独特分析或生物学限制的能力而被有目的地选择；优先考虑原始方法论文、基准或验证研究，以及具有明确观察单元和不确定性报告的人类研究。作为结构化叙述性综述，该过程不包括详尽检索、重复筛选或符合系统综述和荟萃分析首选报告项目(PRISMA)的程序。
2. 队列水平突变模式的概念边界
二元肿瘤-基因矩阵是描述队列水平突变模式的标准表示。在该矩阵中，每一行代表一个个体肿瘤样本，每一列代表一个特定基因，以二元形式指示该基因中的突变是否在该样本中被检测到。然后使用统计检验来评估两个或多个突变同时出现的观察频率是否与每个突变独立发生的假设下的预期频率显著不同，从而区分共现与互斥性(图1)。尽管这种分析方法有助于在大队列中探索性识别突变间关系，但它在解释这些模式的生物学背景方面具有根本局限性。
2.1. 观察单元与证据边界
队列是观察单元的集合；一个患者可以贡献多个病灶、标本或时间点。病灶是解剖学上可区分的肿瘤沉积物，区域是病灶的采样空间细分，克隆是推断的谱系定义群体，细胞是个体物理单元。标本是可能包含多个区域或克隆的采样单元。在批量测序中，检测到两种改变表明它们存在于所分析的材料中，但不能确定它们位于同一细胞内。表1定义了在队列、患者、病灶、区域、克隆、细胞和功能系统水平上支持的推断和主要局限性。
一个局限性是，大规模整合队列分析通常包含原发样本、转移样本和不论治疗史的样本的混合。因此，当具有不同临床和生物学背景的样本组合在单个肿瘤-基因矩阵中时，观察到的突变模式可能部分反映队列水平混杂。当具有不同分子亚型的肿瘤被纳入同一分析人群时，这一关注变得尤为重要。例如，一项寻找乳腺癌互斥突变组合的研究表明，CDH1、AKT1和PIK3CA突变与Luminal A亚型相关，队列水平观察到的突变模式与潜在分子亚型的分布密切相关[11]。乳腺癌由异质性亚型组成——如Luminal A、Luminal B、HER2阳性和基底样——它们具有不同的驱动突变谱[12]。当这些异质性分子亚型被合并作为单一队列分析时，每个亚型的不同突变分布在一个肿瘤-基因矩阵中交织；因此，整个队列观察到的突变模式可能部分反映所包含亚型的不同改变患病率，因此难以将其解释为两个突变之间直接功能协同或互斥性的生物学证据(表1)。这种亚型混合可以减弱、放大或逆转边缘关联，但方向逆转必须被证明而非假设。
2.2. 形式化队列聚合
设A和B为独立肿瘤的二元改变指示符，Z为临床或分子分层，如亚型、组织学、治疗状态或检测面板。合并(边缘)关联比较A和B而不以Z为条件；条件关联在Z的层内或在协变量调整模型中比较它们。它们的协方差分解为层内和层间患病率成分：(1) 在协方差尺度上，当正的层间患病率成分超过平均负的层内协方差时，可以发生从负的层内关联到正的边缘关联的逆转。
一个假设的数值例子说明了辛普森逆转。在高患病率层中，A+B/A-only/B-only/neither计数为61/19/19/1；在低患病率层中，计数为1/19/19/61。每层的比值比(OR)为0.17，而合并计数62/38/38/62产生OR为2.66。该例子包含非零重叠，因此代表负关联，而非完全互斥性。如果在同一观察单元的每个详尽层中A+B=0，合并重叠也保持为零。临床分层聚合和细胞混合是不同的数据生成机制。前者需要分层、协变量调整、相互作用评估和明确的估计目标。后者需要空间、克隆或单细胞定位。粗略到调整的OR变化应谨慎解释，因为OR是不可折叠的，即使在没有混杂的情况下也可能不同。还应报告效应量、置信区间(CI)、层特异性估计和错误发现率(FDR)控制。
第二个局限性是样本间TMB差异可能扭曲突变模式的解释。高TMB的样本包含更多改变调用，增加了无关事件(包括乘客改变)被偶然同时观察到的概率。一项来自癌症基因组图谱(TCGA)的12种主要癌症类型的泛癌研究记录了突变频率和模式因癌症类型而异，并随组织起源、致癌物暴露和DNA修复缺陷状态而变化，说明了关联模型可能需要解决的异质性[13]。与此关注一致，van de Haar等人表明癌症基因组中的许多互斥模式可能受亚型和肿瘤突变负荷的影响，而非反映直接通路上位效应[7]。已开发了几种统计框架来减少在含有超突变样本的癌症类型(如结直肠癌和子宫内膜癌)中可能出现的假阳性互斥信号。例如，已提出将每个样本的内在突变负荷权重纳入统计模型以更严格评估互斥性的方法[14,15]。分别表示驱动和乘客过程的模型也可以减少高乘客突变率基因中的虚假关联[16]。
2.3. 二元队列矩阵用于演化解释的局限性
第三个局限性是常规二元矩阵表示未能反映肿瘤演化过程中突变的时间顺序、其克隆或亚克隆状态、其在同一细胞谱系内的共现，或者它们是否来自空间上不同的肿瘤区域。例如，早期克隆和晚期亚克隆突变——它们具有不同的生物学含义——在二元矩阵中被视为相同突变。事实上，一项泛癌研究发现，与主要通路(如PI3K-AKT-mTOR通路)相关的基因中约15%的突变是亚克隆的[17]，表明驱动改变可能被推断为在所采样材料中是克隆的，或者作为亚克隆且局限于癌细胞亚群。为克服这种常规一维表示的局限性，已开发了联合考虑突变时间顺序和肿瘤演化系统发育的统计模型。通过联合推断互斥的致癌通路和这些通路上突变出现的时间顺序，研究将互斥性解释为突变的存在或缺失，而是在肿瘤进展的演化轨迹内[18]。此外，已开发了同时推断肿瘤系统发育树上出现的互斥模式和复发演化轨迹的技术，从而在克隆演化的背景下对突变间关系进行更多维的理解[19,20]。
3. 肿瘤内共检测：克隆结构和演化组织
大多数实体瘤包含肿瘤演化过程中产生的遗传多样性亚克隆。ITH研究将突变共现的解释从批量样本内的简单共检测扩展到肿瘤潜在克隆结构内的分析[8,21,22]。特别是，使用多区域测序追踪非小细胞肺癌(NSCLC)肿瘤演化的TRACERx队列研究证明了广泛的亚克隆多样化。因此，批量中共同检测的突变可能包括由不同亚克隆携带的分支特异性事件[23,24]。
通过批量测序共同检测的两个突变之间的关系可以通过几种代表性克隆构型来考虑，每种构型具有不同的演化和功能含义(图2)。它们的关键特征、支持的解释和主要局限性总结在表2中。
3.1. 肿瘤内共检测的克隆构型
通过批量水平分析判断在同一肿瘤内共现的两个突变之间的实际关系必须通过将其细分为几种代表性克隆构型来解释，每种构型具有其自身的演化和功能含义(图2)。
构型1：同一克隆内的共现。当突变A和B被分配到同一推断克隆时，它们的克隆共定位与细胞自主相互作用假说兼容，但功能协同仍需要受控扰动(图2a)[22,25]。
构型2：不同亚克隆中的共存。在该构型中，突变A和B在同一肿瘤样本中被同时检测到，但分别位于演化谱系中的不同亚克隆中。由此产生的批量水平共现信号反映了肿瘤内遵循不同演化轨迹的细胞群体的共存[8,26]。这一区分在具有高ITH的肿瘤(如NSCLC和透明细胞肾细胞癌)中尤为重要，其中多个亚克隆竞争增殖和存活优势(图2b)[21,22,24]。实验研究表明，分离到不同亚克隆并不能确立生物学独立性：旁分泌信号、基质或免疫重塑、代谢交换和共享的细胞外资源可以支持非细胞自主协同。Cleary等人证明了Wnt驱动的乳腺癌中亚克隆间的协同[27]。Marusyk等人表明亚克隆群体可以通过非细胞自主相互作用支持肿瘤生长[28]。Janiszewska等人将亚克隆协同与通过调节局部和全身免疫微环境的转移进展联系起来[27,28,29,30]。
构型3：来自创始克隆的亚克隆多样化。在此，携带驱动改变的创始克隆多样化成获得不同额外改变的亚克隆。在NSCLC TRACERx研究中，包括EGFR、MET、BRAF和TP53在内的基因改变被分类为所分析肿瘤中的克隆性改变，而涉及PIK3CA、NF1和DNA修复相关基因的改变提供了亚克隆事件的例子[24]。这些观察表明，即使在同一肿瘤中共同检测到的突变也占据演化层级中的不同位置，分布在形成共同祖先克隆的树干和随后亚克隆的分支之间。此外，一些亚克隆突变可能通过肿瘤进展和治疗期间施加的选择压力被选择性扩增，随后成为优势克隆的标志物[31]。因此，即使在同一肿瘤中共同检测到的突变也必须考虑从创始克隆分支出的亚克隆的突变组成和选择过程来解释(图2c)。
构型4：同一谱系内的顺序积累。在此，A阳性谱系产生随后获得突变B的亚克隆。也就是说，所有携带突变B的细胞都携带突变A，但并非所有携带突变A的细胞都携带突变B。在批量测序中，CCF或拷贝数校正的VAF差异可以使这种层级与数据兼容，但仅凭CCF_A > CCF_B并不能证明B是从A衍生的，或者该组合驱动了选择性扫描。单独的较低频率B分支和多种替代树可能仍然兼容[8,26,32](图2d)。
构型5：空间或区域异质性。最后，在同一肿瘤内共同检测到的两个突变可以跨采样区域空间分离。根据多区域测序研究，即使在同一肿瘤内，空间分离的区域在主要突变谱和CNA以及免疫微环境中也可能表现出显著差异；因此，批量共检测也必须根据肿瘤的三维空间异质性重新解释(图2e)[22,33,34]。
3.2. 多区域和系统发育分析
上述克隆构型可以通过比较多个采样区域的突变谱并重建其演化关系来研究[8,22,24]。多区域测序有助于确定在一个样本中共同检测到的突变是否跨采样区域共享，还是局限于空间定位的亚克隆。在一项透明细胞肾细胞癌患者的研究中，原发性和转移性肿瘤的多区域测序证明了采样区域间突变谱的显著差异。系统发育重建支持分支演化模型，其中亚克隆从创始克隆分化而来[35]。同样，一项NSCLC多区域测序研究显示，一些突变对应于跨多个肿瘤区域共享的早期克隆事件，而另一些则局限于特定区域并与亚克隆形成相关[21]。这些发现表明同一肿瘤内的突变不一定占据相同的演化层级。
采样单元也必须明确。队列可能包含来自同一患者的重复原发、转移、复发或治疗后标本；将它们视为独立肿瘤会夸大有效样本量并使患者权重不均。横断面患者水平分析应保留每位患者的一个预设标本，或使用考虑患者内依赖性的模型。病灶水平共存在和区域共定位需要匹配的解剖采样，未采样区域仍然是不确定性的来源。
循环肿瘤DNA是复合分析物。在同一血浆样本中检测到的A和B可能来自一个双阳性病灶或来自不同的转移沉积物，并且病灶特异性脱落随部位、负荷、血管通路、周转和治疗而变化[36,37]。因此，血浆共检测不能在没有匹配组织或来源定位策略的情况下确立病灶水平、克隆水平或同细胞共现。
已开发了几种系统发育重建算法，包括PhyloWGS、CITUP和ClonEvol，用于分析批量和多区域数据。这些方法整合从批量测序衍生的VAF和CNA信息，在明确的纯度、拷贝数、多重性和采样假设下估计与每个突变相关的CCF。此外，它们将表现出相似CCF分布的突变聚类为共同的亚克隆单元，并推断它们之间的亲子关系，从而生成与建模数据兼容的一个或多个系统发育重建[26,38,39]。
3.3. VAF和克隆推断
在单样本批量测序数据的分析中，VAF为推断突变的克隆状态提供了有用的线索。在调整肿瘤纯度、局部拷贝数和突变多重性后，可以估计突变的CCF，其不确定性取决于测序深度、纯度、局部总拷贝数和等位基因特异性拷贝数、突变多重性以及假定的克隆模型。高CCF指示采样时间点的高细胞患病率；它本身并不能证明早期时间获取，低CCF也不自动识别晚期事件[8,26]。
应用VAF/CCF信息可以约束但不能唯一确定层级关系。两个高CCF改变在所采样材料中可能是克隆的，但获取时间不同。如果CCF_A超过CCF_B，B可能嵌套在A阳性谱系内，或占据单独的较低频率分支。鸽笼、求和和交叉约束可以拒绝某些构型，尤其是在多个样本中，但点估计应伴随置信或可信区间以及替代兼容树[8,26,32,38,39]。
3.4. 对治疗靶向的意义
表征突变模式下的克隆构型可以为靶点选择和联合策略的假设提供信息。如果两个可靶向突变在同一克隆内共存并共同促进该克隆的存活和增殖，则同时抑制两条通路的组合靶向可能有效。相反，如果两个突变被分离到不同亚克隆中，并且每个群体有助于疾病维持，则可能值得评估解决两个群体的策略[24,33]。这些治疗假设仍然是有条件的：同克隆定位不能证明通路协同，而分离克隆可以非细胞自主协同，并且可能需要测试克隆间相互作用而非仅克隆特异性效应。
推断存在于大多数癌细胞中的早期树干改变可以提供广泛的靶点覆盖，而分支特异性靶点可能留下遗传上不同的群体未治疗。然而，仅克隆性并不能确立靶点依赖性、治疗指数或反应。因此，演化知情治疗设计应考虑靶点在采样克隆中的分布以及未靶向群体在治疗下存活和扩增的可能性[22,33]。
4. 单细胞共现和演化潜力
4.1. 从克隆结构到细胞分辨率
多区域测序和系统发育推断约束了突变共检测的克隆组成和演化背景，但不能确定两个改变是否存在于同一个体细胞中。这些方法在显式模型假设下从群体水平VAF和CNA测量推断细胞患病率和谱系关系。因此，同细胞定位需要细胞水平或分子连接证据，并以适当的可调用性和错误控制解释。
在此背景下，克隆共现应与同细胞共检测区分。通常，克隆被定义为源自共同祖先并共享特定突变组合的细胞群体。然而，即使在相同的克隆群体内，持续的基因组不稳定性可能导致额外突变或细微CNA改变的获取，导致单细胞水平的异质性突变组成[40,41]。因此，即使两个突变通过批量或多区域分析被分配到同一克隆，它们在细胞分辨率的联合分布仍需要在适当的可调用性和错误控制下评估。
4.2. 共现的细胞构型
scDNA-seq分析单个细胞中的突变，使得在同一肿瘤内检测到的多个突变的分布可以在单细胞水平评估。当两个位点均可调用时，这些数据可以区分由不同细胞群体产生的混合信号与同一细胞内的联合检测或低频细胞群体内的联合检测。这种细胞水平测量为克隆水平观察到的共现模式的定位提供了更高分辨率的证据(图3)[41,42,43]。
构型1：同一细胞内的共现。这指的是突变A和B在同一单个肿瘤细胞内被同时识别的情况。这一发现支持在所述调用标准下的同细胞定位，并提名(但不证明)细胞自主相互作用(图3a)[40,43]。例如，对患者来源的TRAF7/AKT1-和TRAF7/KLF4突变脑膜瘤的scDNA-seq鉴定了双突变细胞基因型并解析了突变获取的顺序[43]。
构型2：跨细胞群体的分离。即使突变A和B通过批量测序被同时检测到，它们在单细胞水平可能不在同一细胞内共存。相反，它们可能被分离到由突变A阳性细胞和突变B阳性细胞组成的不同细胞群体中，在所采样的、共同可调用的细胞中显示细胞分离；未检测到A+B细胞并不在没有足够敏感性和功效的情况下确立完全互斥性。基于单细胞突变谱的谱系树分析用于从这些细胞水平突变组合推断不同的细胞谱系和分支结构(图3b)[44]。例如，在接受IDH2抑制剂治疗的急性髓系白血病患者中进行的纵向scDNA-seq揭示了携带IDH1、FLT3、NRAS和PTPN11的不同亚克隆的平行演化，说明在同一患者内检测到的改变可以保持跨细胞群体分离[45]。
构型3：单突变和双突变细胞的混合。在肿瘤内可以共存仅携带突变A的细胞、仅携带突变B的细胞以及同时携带突变A和B的细胞。例如，骨髓肿瘤中的单细胞突变研究表明，携带不同突变组合的细胞群可以在单个患者样本中共存，并且某些亚组表现出以多个突变的顺序积累为特征的层级结构[41]。这表明具有不同突变谱的细胞在同一肿瘤内共存，并提示获得额外突变的细胞群可能在随后的选择压力下扩增为优势亚克隆(图3c)。
构型4：低频双突变群体。即使在仅携带单一突变的细胞构成肿瘤细胞多数的环境中，同时携带突变A和B的低丰度细胞群体仍可能存在[41,45]。在一名急性髓系白血病患者中，scDNA-seq鉴定了TET2单突变细胞以及TET2-U2AF1双突变和更复杂的后代群体，提供了混合突变定义细胞群体的直接临床例子[45]。这种稀有细胞群体难以检测，因为它们的信号在整体肿瘤信号中被稀释并低于批量测序的检测限。一项关于核心结合因子急性髓系白血病的近期研究提供了这种低频群体的临床例子：scDNA-seq在完全缓解期间检测到仅占细胞0.16–1.54%的残留肿瘤细胞，包括携带多个基因组改变的稀有细胞[40]。除非纵向或扰动证据将其与后续存活和扩增联系起来，否则稀有治疗前A+B群体应被描述为候选群体[46]。在单细胞水平检测这些稀有突变细胞群体的策略及其治疗意义在4.3节和4.4节详细讨论(图3d)。
4.3. 稀有突变细胞群体的检测
当携带特定突变的细胞群比例极低时，该突变的信号可能被整体肿瘤的主要克隆信号稀释，使批量测序难以检测[41,47]。近期发展包括scDNA-seq和联合单细胞DNA/RNA测序，它们增加了可用于解析低频突变定义群体的细胞水平测量的数量和类型[45,48,49]。增加的通量可以通过增加信息细胞数量来提高检测稀有群体的概率，尽管有效敏感性仍取决于联合位点可调用性、等位基因缺失、测序错误和采样深度。scDNA-seq分析可以在两个位点可调用且技术伪影受控时测试单个细胞中的突变组合，从而作为识别可能与治疗后复发或治疗耐药相关的稀有细胞群体的有用方法。
阳性和阴性单细胞证据具有不同的错误结构。表观A+B细胞可能来自双联体、污染、扩增错误或假阳性调用，而未检测到A+B可反映等位基因缺失、不完整位点覆盖、偏向捕获或有限细胞数[50,51,52]。如果真实A+B频率为f，联合检测敏感性为s，并且n个信息细胞被独立采样，检测功效为：(2) 对于f = 0.01，s = 0.70和95%功效，需要约427个信息细胞。如果观察到零个A+B细胞，粗略敏感性调整的95%上限为3/(ns)。分母必须是两个位点通过预设可调用性标准的细胞数，而非名义捕获液滴数。
在急性髓系白血病中进行的scDNA-seq研究在单细胞水平追踪了与治疗反应和复发相关的克隆结构。通过在单细胞分辨率检测突变，这些研究重建了复杂的克隆演化模式，包括线性演化、分支演化和趋同演化。此外，通过整合治疗期间从同一患者收集的纵向样本，他们通过追踪在选择压力下存活或扩增为优势克隆的亚克隆，识别了治疗耐药背后的演化轨迹[45]。另一项在同一癌症队列中进行单细胞突变谱分析的研究表明，克隆分布模式可能因突变类型而异。值得注意的是，表观遗传调控因子中的突变倾向于在同一克隆内共同积累，而信号基因中的突变通过独立出现在不同亚克隆中表现出互斥模式[41]。总之，单细胞分析可用于揭示可能被批量测序检测限制掩盖的稀有亚克隆，并解释它们携带的突变组合，以及它们在治疗前后克隆重塑期间如何演化。这些研究保留平台、面板、采样和可调用性依赖性限制，因此重建的谱系和稀有群体未检测应报告显式不确定性。
4.4. 药物耐药和非遗传药物耐受
预先存在的遗传耐药、治疗期间获得的耐药突变、可逆药物耐受持久细胞状态和治疗后克隆扩增必须区分(图3e)。治疗后扩增是观察到的克隆丰度变化，其本身不能确定耐药是预先存在的、遗传获得的，还是由可逆细胞状态介导的。药物耐受状态可以在没有稳定耐药突变的情况下发生，并可能在停药后逆转[53]。稳定的遗传耐药可以从预先存在的克隆、治疗期间或持久状态后通过不同演化途径出现[46,54]。声称治疗前群体预测耐药需要治疗前确定、预设的后续结果以及纵向或扰动验证。
单细胞多组学提供了一种将遗传耐药和非遗传细胞状态联系起来而不将它们视为等同的方法。这些测定可以联合分析同一细胞中的DNA突变、CNA和转录状态，从而可以估计基因型-状态关联[48,49]。将这些测量与药物反应数据整合可以产生更具体的假设；功能性和预测性主张仍需要扰动和纵向验证。
5. 解析突变共现和互斥性的方法学方法
已开发了多种方法学方法来检测和解释突变共现和互斥性，但它们解决不同的推断问题，而非简单的连续增加准确性。队列水平方法估计统计依赖性，多区域和系统发育方法约束空间或克隆位置，单细胞方法在平台特异性错误约束下评估细胞共检测。因此，表1和表3按与每次分析相关的问题、输入、假设、不确定性和失败模式组织了方法。
5.1. 队列水平统计和组合方法
队列水平统计方法评估二元改变矩阵中的共现或互斥性。Fisher精确检验提供了基本的成对独立性检验，但它不考虑样本特异性TMB、基因特异性改变概率、肿瘤亚型或队列组成。纳入基因和样本特异性事件率的模型可以减少由异质性突变负荷产生的虚假关联或互斥信号[3,14,15]，而分离驱动和乘客过程的模型解决了背景率失真的不同来源[16]。最低报告应包括改变定义；检测覆盖/机会和相应分母；A+B/A-only/B-only/neither计数；带95% CI的效应量；零模型；协变量或分层；功效考虑；多重性校正。基因水平二值化可能合并功能不同的变体；面板效应、突变特征、同臂拷贝数事件和重复标本需要敏感性分析。
基于组合优化的方法超越个体基因对，分析由多个基因组成的更广泛突变集。这些方法不依赖预定义通路或基因集，而是识别在许多患者中频繁观察但在个体肿瘤内很少重叠的互斥基因组合，从而提名可能涉及共享癌症相关通路或生物学过程的候选驱动模块[60,61]。此外，将以观察到的改变频率为条件的精确检验与马尔可夫链蒙特卡罗搜索相结合的方法可以识别包括低频突变在内的统计显著互斥突变集，并评估此类模式是否在特定肿瘤亚型中复发[11]。正依赖性应与互斥性一起考虑。SELECT和SelectSim从队列水平改变模式评估依赖性，而GeneAccord检验基因或通路对在患者特异性克隆分配中克隆共现或克隆互斥构型中比预期更频繁复现，同时考虑克隆间的演化依赖性。这些输出在其所述分辨率下是统计证据，不确立同细胞定位、功能协同或因果关系[30,55,56]。
5.2. 通路和网络引导方法
通路和基于网络的方法将突变关系置于通路或信号网络内，而非仅将其视为成对统计模式。具体而言，将突变、CNA和表达变化与蛋白质相互作用网络整合可以提名连接的互斥模块[4]。此外，使用共享下游信号效应的基因集允许识别汇聚在相似信号结果上的不同遗传改变。功能冗余可以产生共改变提供有限额外选择性优势的假设，但网络支持的互斥模式本身并不能证明该机制[57]。此外，通过在蛋白质-蛋白质相互作用网络中联合分析患者水平突变覆盖和互斥信息，这些方法可以识别在许多患者中复发但在个体肿瘤内表现出最小重叠的基因组合，从而促进在网络连通性背景下识别候选癌症驱动模块[58]。
5.3. 时间和演化方法
时间和演化方法将突变共现和互斥性与肿瘤进展期间事件顺序的模型联系起来。等待时间模型将改变发生与肿瘤被观察的时间联系起来，从而将队列水平互斥模式置于假设的时间进展模型内[59]。通路水平扩展推断通路事件之间的偏序，允许在建模的进展结构内解释互斥性[18]。此外，当主要基因组改变在肿瘤进展树或肿瘤遗传树结构内建模时，跨队列观察到的突变组合可用于推断每个改变沿建模进展轨迹的相对位置。通过这一框架，观察到的互斥模式可以被解释为沿进展通路推断为顺序发生的事件或与不同演化分支中选择的替代通路相关的事件[19,20]。这些进展模型在显式假设下组织横断面模式；它们不直接观察时间获取，并且当时间性至关重要时应与纵向或多样本证据对照检查。
5.4. 克隆和系统发育推断
通过多区域测序和系统发育克隆推断，队列水平突变模式可以在肿瘤空间和克隆结构的背景下解释。多区域测序分析同一肿瘤的不同区域，以评估共检测突变是否跨采样区域共享，还是局限于特定区域或亚克隆群体。当额外应用系统发育克隆推断方法时，可以整合VAF、CNA和肿瘤纯度信息，以在纯度、拷贝数、多重性和树假设下估计兼容的亚克隆分配和演化层级。这些方法有助于评估共检测突变是否被分配到同一克隆、分离到不同亚克隆，或在推断演化模型下与树干与分支放置兼容[26,38,39]。
5.5. 单细胞和多组学方法
单细胞分析提供了一种更高分辨率的方法来测试批量水平共检测的突变是否在指定调用标准下在同一细胞内被检测到。scDNA-seq能够检查单个细胞的突变谱，从而区分两个突变是在同一细胞内联合检测、分离到不同细胞群体、还是局限于低频双突变细胞群体[41,43,45]。这些测量有助于确定常规批量测序中观察为共现的突变模式是否代表单细胞水平的联合检测，还是反映来自不同克隆或细胞群体的混合信号[41,43]。
此外，单细胞DNA/RNA多组学方法添加了转录状态信息。通过同时评估同一细胞中的突变、拷贝数状态和RNA水平细胞状态，这些方法可用于测试特定突变组合是否与药物耐受状态、适应状态或治疗耐药相关[48,49]。特别是，这些方法可以识别低频群体中的候选基因型-状态组合；声称此类群体预测复发或耐药需要预设的纵向验证[40,41,45,46]。
5.6. 功能验证框架
统计关联是发现信号。正关联不确立功能协同，同细胞检测不证明上位效应，克隆分离不排除非细胞自主协同，负关联不证明合成致死。主张应限于最高完成验证阶段所支持的内容。实用的验证序列如下：(1) 具有效应量、CI、FDR和敏感性分析的调整发现；(2) 独立复制；(3) 病灶、区域、克隆或细胞定位；(4) 使用预设结果测量的野生型、A、B和A+B的等基因2×2比较；(5) 拯救、通路、竞争、共培养或介质阻断研究；(6) 相关体内或纵向临床验证。对于细胞自主假设，靶点参与、剂量反应分析、时间过程分析和拯救实验加强机制解释。对于克隆间假设，亚克隆的因子混合物、条件培养基、transwell或直接共培养、谱系追踪和竞争实验可以区分接触依赖和分泌因子效应[27,28,29]。作为这种验证逻辑的例子，Wenta等人测试了跨工程细胞、器官型培养、动物模型和人体组织的背景依赖性组合表型，而非仅从基因组模式推断功能协同[62]。治疗主张需要适当的联合效应零模型、选择性和毒性评估、复制以及背景相关的体内证据。临床预测额外需要治疗前确定、预设结果、时间优先性和外部或前瞻性验证。
6. 未来方向
未来研究应开发多水平模型，将来自变异调用、拷贝数估计、纯度、突变多重性、克隆聚类、系统发育重建和单细胞可调用性的不确定性传播到最终关联或定位推断中。此类模型应连接患者、病灶、区域、克隆、细胞和时间，同时考虑重复测量和替代兼容克隆构型。组织和循环肿瘤DNA的整合将额外需要显式建模不等病灶脱落和采样不确定性。需要更多关注事件定义和功能验证。当样本量允许时，变体水平和多模态表示应区分热点功能获得变体、截短功能丧失变体、局部拷贝数事件、结构变体和非遗传细胞状态。跨队列分析应协调检测机会、面板设计、标本类型、治疗背景和事件注释。人工智能(AI)和机器学习(ML)方法可以通过建模复杂基因组背景和优先化候选遗传依赖性来补充这些分析。近期方法包括用于元素和癌症特异性背景突变率估计的迁移学习模型，以及将实验测量的癌症依赖性转化为患者肿瘤以识别患者相关脆弱性和候选合成致死关系的ML框架[63,64]。这些预测应被视为补充建模和优先化工具，而非生物相互作用的直接证据。它们本身不能确立物理定位或同细胞居留，预测的依赖性需要独立的功能和扰动验证。最后，计算提名的依赖性应优先使用等基因编辑、组合筛选、谱系分辨竞争、类器官或共培养系统以及背景相关的体内验证进行扰动测试。总之，这些进展应改善跨空间和演化背景的突变依赖性解释和实验优先化。
7. 结论
癌症基因组数据中观察到的突变模式为解释个体突变之间的关系提供了重要线索；然而，其生物学意义根据队列组成、瘤内克隆结构、空间异质性和治疗选择压力等多维背景而变化。解释这些模式需要从队列水平关联到肿瘤内定位，并在适当时进行功能和临床验证的连贯进展。关于肿瘤内共现的主张需要将批量共检测定位到病灶、区域、克隆或细胞水平；VAF/CCF和系统发育结果应报告不确定性和替代兼容构型；单细胞未检测的解释需要联合可调用性和功效分析。因此，突变共现是一种多水平信号，其统计、空间、功能、治疗和预测解释需要不同但相互关联的证据形式。
