《Microorganisms》：Gut Microbiota-Elicited Aberrant Phosphorylation Induces Protein Structural Anomalies: A Non-Negligible Pathogenic Driver of Autism Spectrum Disorder
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自闭症谱系障碍（ASD）是一种异质性神经发育疾病，以社交互动受损和重复刻板行为为特征，其发病机制尚未完全阐明。肠道菌群已成为ASD的关键调节因子；然而，其对海马蛋白质组和磷酸化蛋白质组特征的影响尚未得到充分表征。在本研究中，研究人员通过将自闭症儿童和典型发育对
自闭症谱系障碍（ASD）是一种异质性神经发育疾病，以社交互动受损和重复刻板行为为特征，其发病机制尚未完全阐明。肠道菌群已成为ASD的关键调节因子；然而，其对海马蛋白质组和磷酸化蛋白质组特征的影响尚未得到充分表征。在本研究中，研究人员通过将自闭症儿童和典型发育对照儿童的粪便样本移植到抗生素处理的小鼠中，进行了粪菌移植（FMT）。来自自闭症儿童的肠道菌群在受体小鼠中诱导了多种ASD样行为，并伴有小胶质细胞、星形胶质细胞和神经元的异常激活，以及神经发生受损。磷酸化蛋白质组分析结合基因本体论（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）分析显示，差异磷酸化蛋白主要富集于突触相关通路。ASD来源的菌群显著降低突触密度，下调突触蛋白SYP和PSD-95，并抑制血脑屏障（BBB）紧密连接蛋白的表达。使用AlphaFold3（AF3）和HADDOCK进行的计算结构模拟进一步支持ASD-FMT可能促进异常磷酸化，从而重塑SHANK3和SRRM2构象并削弱SHANK3的结合亲和力。整合蛋白质组和磷酸化蛋白质组筛选鉴定出FNDC3A为自闭症儿童肠道菌群上调的潜在易感相关蛋白，并通过Western blotting和ELISA分别在小鼠海马组织和自闭症儿童血浆样本中得到验证。在机制上，ASD发病机制不仅可能归因于经典ASD易感基因的失调，还可能归因于肠道菌群驱动的多种蛋白质结构的翻译后磷酸化重塑。重要的是，本研究建立了一个创新的研究框架，将计算分析与湿实验相结合，从肠道菌群诱导的海马磷酸化蛋白质组改变的角度为ASD发病机制提供了新见解，并揭示了ASD背后一个合理的分子机制。
论文解读：肠道菌群通过异常磷酸化驱动自闭症谱系障碍的蛋白质结构重塑
自闭症谱系障碍（ASD）是一类异质性神经发育疾病，核心表现为社交互动障碍与重复刻板行为，其发病率近年持续上升，但发病机制尚不完全清楚。已有证据表明，ASD儿童存在肠道菌群失调，肠道菌群通过肠-脑轴影响大脑功能和行为。然而，肠道菌群如何影响海马蛋白质表达及翻译后修饰，特别是磷酸化修饰，此前缺乏系统研究。基于此，研究人员开展本研究，旨在通过粪菌移植（FMT）构建ASD小鼠模型，结合蛋白质组学、磷酸化蛋白质组学、计算结构生物学和湿实验，系统解析肠道菌群驱动ASD发病的分子机制。该研究发表在《Microorganisms》期刊上。
关键方法：研究人员从山东大学附属儿童医院招募20名ASD患儿和20名性别年龄匹配的典型发育对照儿童，采集粪便和血浆样本，其中每组各5份粪便样本混合后用于FMT。将抗生素清除肠道菌群的小鼠随机分为ASD-FMT组和Control-FMT组，分别灌胃ASD儿童或对照儿童粪便悬液。随后进行行为学测试（旷场、三箱社交、埋珠）、16S rRNA基因测序、免疫荧光染色、蛋白质组和磷酸化蛋白质组学（数据非依赖采集模式）、GO/KEGG/GSEA富集分析、AlphaFold3结构预测、HADDOCK分子对接、Golgi染色、Western blot和ELISA验证。以上方法覆盖了从菌群、行为、蛋白到结构的多层次研究。
3.1 FMT诱导的肠道菌群改变和受体小鼠自闭症样行为：16S rRNA测序显示，抗生素处理后菌群多样性显著降低，FMT后两组菌群结构明显分离。行为学上，ASD-FMT小鼠出现社交新颖性偏好缺陷、自发活动减少、中心区探索减少（焦虑样行为）和埋珠数量增多（重复刻板行为），表明ASD儿童菌群可在小鼠中重现多种ASD样表型。
3.2 ASD-FMT引起胶质细胞和神经元过度激活并抑制神经发生：免疫荧光染色显示，ASD-FMT小鼠海马CA1、CA2和DG区IBA1（小胶质细胞标记）和GFAP（星形胶质细胞标记）荧光强度显著增加；c-Fos阳性神经元数量在CA1、DG和大脑皮层增多；DCX（未成熟神经元标记）阳性细胞荧光强度降低，表明神经发生受损。
3.3 ASD-FMT后差异蛋白表达有限：蛋白质组学鉴定到约7300个蛋白，仅29个蛋白差异表达（14个上调，15个下调），包括FOXP1、FBXL4、FNDC3A等。GO/KEGG富集显示与B细胞分化、磷酸化依赖性蛋白结合等有关。GSEA显示突触后结构成分减少及MECP2表达和活性失调。说明蛋白质组变化相对有限，提示需关注磷酸化修饰。
3.4 ASD-FMT后差异磷酸化蛋白和磷酸化肽显著变化：磷酸化蛋白质组学共鉴定30,137条磷酸化肽，对应3971个蛋白；19,597个class I磷酸化位点中，pSer占77.9%，pThr占17.7%，pTyr占4.4%。其中SRRM2蛋白含172个磷酸化位点。与对照组相比，479条磷酸化肽显著改变（229上调，250下调）。基序分析显示精氨酸导向的丝氨酸磷酸化基序最丰富。
3.5 差异磷酸化蛋白富集于突触相关通路，ASD菌群降低突触密度和蛋白表达：KEGG和GO分析显示，差异磷酸化蛋白富集于神经退行性疾病通路和突触相关通路（突触、突触后密度、突触前后成分、突触后结构成分等）。Golgi染色显示ASD-FMT小鼠海马神经元树突棘密度显著降低；Western blot证实突触前蛋白SYP和突触后蛋白PSD-95表达显著下调。说明异常磷酸化可能通过影响突触相关通路导致突触功能障碍。
3.6 ASD-FMT抑制受体小鼠血脑屏障紧密连接蛋白表达：Western blot检测显示，ASD-FMT组海马组织ZO-1、Occludin-1和Claudin-5表达均显著降低，提示ASD儿童菌群可能损害血脑屏障完整性。
3.7 ASD-FMT诱导的异常磷酸化可改变蛋白质构象并削弱结合亲和力——以SHANK3和SRRM2为例：磷酸化蛋白质组显示SHANK3在S482位点发生超磷酸化，SRRM2在多个位点（如S1832、S1834、T1836等）磷酸化水平改变。AlphaFold3预测表明，S482磷酸化可导致SHANK3构象显著变化（RMSD=46.510 ?），SRRM2磷酸化也预测产生大幅构象变化（RMSD>50–60 ?）。HADDOCK分子对接显示，S482磷酸化使SHANK3与Homer1的结合自由能从-5.4 kcal/mol升至-1.8 kcal/mol（ΔΔG=3.6 kcal/mol），表明异常磷酸化削弱了SHANK3与Homer1的结合。
3.8 ASD儿童肠道菌群诱导FNDC3A上调：整合蛋白质组和磷酸化蛋白质组分析，发现FNDC3A、FCHO2和BAP18三个重叠蛋白。其中FNDC3A在ASD-FMT组表达升高，而S203位点磷酸化显著降低。Western blot验证小鼠海马FNDC3A蛋白升高；ELISA证实ASD儿童血浆FNDC3A水平显著高于对照儿童。提示FNDC3A可能是肠道菌群调控的ASD易感候选蛋白。
讨论与结论：讨论部分指出，ASD儿童菌群可在小鼠中引起多种ASD相关表型，并伴随胶质细胞激活、神经元过度激活和神经发生受损。与蛋白质组相比，磷酸化蛋白质组揭示的差异信号更丰富，且富集于突触相关通路。异常磷酸化可通过改变SHANK3、SRRM2等关键蛋白构象和相互作用参与ASD发病。此外，研究还发现FNDC3A作为潜在易感蛋白，其表达受肠道菌群调控。研究局限包括计算模型为预测性假设，需NMR、冷冻电镜、SAXS等实验验证；FNDC3A的功能缺失/获得实验和BBB通透性功能实验需进一步开展；且菌群改变具有队列特异性。结论部分（翻译）：总体而言，来自ASD儿童的肠道菌群可能通过多种机制驱动发病机制，包括诱导ASD样行为表型、胶质细胞和神经元过度激活、神经发生受损、突触相关蛋白和信号通路下调，以及关键血脑屏障紧密连接蛋白表达受损。值得注意的是，磷酸化蛋白质组分析揭示的分子信号通路，尤其是通过KEGG和GO富集分析反复识别出的突触相关通路，与ASD儿童肠道菌群改变的相关性比传统蛋白质组学单独发现的信号更强。此外，研究人员建立了一个整合研究框架：首先进行蛋白质组和磷酸化蛋白质组分析，以识别携带异常磷酸化位点、可能与肠道菌群驱动的ASD发病相关的候选蛋白；然后整合计算结构预测和分子对接模拟，再通过综合湿实验验证突触通路、靶蛋白、关键BBB紧密连接蛋白等。最终，虽然单基因突变（如重复和缺失）导致异常基因表达在ASD中已被公认，但本研究结果表明，肠道菌群驱动的翻译后修饰（如蛋白磷酸化）及随后的结构重塑也可能是ASD启动的关键因素。未来ASD机制研究不能忽视环境调节因子（尤其是肠道菌群）如何调节蛋白质翻译后修饰以促进ASD发病。
