《Current Biology》：Growth directions and stiffness across cell layers determine whether tissues stay smooth or buckle
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自然界中的器官表现出多种形状和形式，从平滑到波状形态不等。细胞如何协调其生长以产生光滑的叶片和萼片等叶状器官仍不清楚。研究人员鉴定了一个突变体as2-7D，其在外表皮异位表达ASYMMETRIC LEAVES 2 (AS2)。分析显示，异位AS2表达导致as2
自然界中的器官表现出多种形状和形式，从平滑到波状形态不等。细胞如何协调其生长以产生光滑的叶片和萼片等叶状器官仍不清楚。研究人员鉴定了一个突变体as2-7D，其在外表皮异位表达ASYMMETRIC LEAVES 2 (AS2)。分析显示，异位AS2表达导致as2-7D萼片的外表皮在萼片发育早期发生屈曲。屈曲是由跨表皮层相互冲突的细胞生长方向和不相等的组织刚度引起的。在as2-7D中过表达细胞周期蛋白依赖性激酶（CDK）抑制剂Kip相关蛋白1（KRP1）可使外表皮细胞的生长方向沿纵轴对齐，增加外表皮的整体刚度，并恢复萼片的平滑性。进一步的实验表明，屈曲促进生长素外排转运蛋白PIN-FORMED 1（PIN1）的汇聚，从而启动尖状突起。因此，研究人员证明，在拟南芥（Arabidopsis thaliana）萼片中，早期发育阶段沿纵轴的生长以及两个表皮层之间相当的刚度对于保持平滑是必需的，如野生型所见。研究结果表明，除了分子线索影响组织力学外，组织力学也可以调节分子信号，从而产生明确的形状。
研究背景与科学问题
自然界中器官形态从平滑到波状、折叠不等。平滑的叶片和萼片有利于光吸收、气体交换以及保护花蕾；而脑回、肠袢等复杂形态常由机械屈曲产生。尽管屈曲的力学基础已较清楚，发育中的组织如何调控细胞生长与材料属性，从而在某些情况下产生屈曲、在另一些情况下抑制屈曲以维持平滑器官表面，仍不清楚。在植物中，ASYMMETRIC LEAVES 2（AS2）是近轴面特征建立的关键转录因子，但AS2如何影响细胞生长和组织力学以维持平滑器官形态尚不清楚。为此，研究人员以拟南芥（Arabidopsis thaliana）萼片为模型开展研究，论文发表在《Current Biology》。
研究人员开展的工作与主要结论
研究人员通过正向遗传筛选鉴定出显性突变体as2-7D，其AS2启动子起始密码子上游1484 bp处发生G→A突变，破坏KANADI抑制子结合位点，导致AS2在萼片外表皮异位表达。表皮特异启动子ML1驱动AS2（pML1::AS2）可模拟as2-7D的皱褶和突起，证明异位AS2表达足以破坏萼片平滑性。活体时序成像显示，外表皮先出现屈曲/皱褶，随后才形成突起；细胞生长速率与分裂率分析排除局部过度生长假说，支持全表面生长模式紊乱造成的机械屈曲。解析模型和数值模型预测，屈曲需同时满足两个条件：外表皮处于压应力，并且外表皮刚度显著低于内表皮。实验证实，野生型内外表皮细胞沿纵轴高度对齐生长，且两层表皮刚度相近；as2-7D外表皮细胞生长方向转为横向，刚度降低，内表皮生长速度低于野生型，导致外表皮在纵向上受约束但横向过度扩张，最终屈曲。在as2-7D中过表达KRP1（pML1::KRP1 as2-7D）可使外表皮细胞重新沿纵轴伸长，增加外表皮刚度，显著抑制屈曲和突起。极性标记REV、FIL表达模式在as2-7D萼片中未见异常，且REV并非屈曲或突起形成所必需，提示屈曲并非由近-远轴极性边界异位直接引起。进一步活体成像显示，PIN1-GFP在屈曲末端汇聚，DR5报告基因显示局部生长素最大值，随后突起在该处形成；NPA抑制极向生长素运输后，突起减少但屈曲仍发生，说明屈曲通过力学应力促进PIN1汇聚，继而启动突起。
主要关键技术方法
主要方法包括：①EMS正向遗传筛选与图位克隆，来源为Ler-0背景M2群体并经两次回交；②活体共聚焦成像结合MorphoGraphX进行细胞谱系追踪，量化外表皮、内表皮和叶肉细胞的生长速率、分裂率及最大生长主方向；③建立解析模型和二维有限元数值模型，预测层间差异生长与刚度对屈曲的影响；④高渗溶液处理使细胞质壁分离，通过细胞壁收缩程度估计表皮层相对刚度；⑤利用NPA抑制极向生长素运输，并使用pAS2、proREV、proFIL、pPIN1::PIN1-GFP、DR5等报告基因进行验证。
研究结果
1. AS2的异位表达破坏萼片平滑性
通过正向遗传筛选获得as2-7D，图位克隆证实AS2启动子突变导致外表皮异位AS2表达；表皮特异表达AS2足以复制皱褶和突起表型，说明异位AS2表达是表型的原因。
2. as2-7D外表皮先发生屈曲，随后形成突起
活体成像显示，早期野生型和as2-7D外表皮均平滑；as2-7D在48小时出现皱褶，随后屈曲加剧，突起仅在后期出现。初始阶段无局部快速增长或分裂，说明皱褶不是局部生长造成，而可能是全表面生长紊乱引起的机械屈曲。
3. 模型预测屈曲需要两个条件
解析模型和数值模拟表明，当外表皮相对内表皮和叶肉过度生长而产生压应力，且外表皮刚度显著低于内表皮时，外表皮会优先屈曲；若两层刚度相近，组织只发生整体弯曲而不屈曲。
4. 两个表皮层之间对齐的生长方向对平滑萼片形成至关重要
野生型内表皮生长快于外表皮，以配合萼片由弯曲变平坦的形态变化；as2-7D外表皮最大生长方向转为横向，内表皮仍沿纵轴但生长速率下降，导致两层表皮面积失衡。微管排列在as2-7D外表皮紊乱。KRP1过表达使外表皮细胞沿纵轴伸长并抑制屈曲，证明生长方向对齐是关键因素。
5. 刚度降低促进as2-7D外表皮屈曲
渗透处理显示野生型内外表皮收缩程度相近，表明刚度相当；as2-7D外表皮收缩明显大于内表皮，说明外表皮更软。KRP1过表达提高as2-7D外表皮刚度并恢复平滑，符合模型预测。
6. 早期as2-7D萼片的屈曲没有明显近-远轴极性网络紊乱
REV和FIL表达在野生型与as2-7D中无差异；在rev-6背景下表达AS2仍能形成屈曲和突起，说明REV不是必需。kan1 kan2突变体萼片也未出现类似as2-7D的皱褶和突起，支持屈曲并非由极性边界异位直接造成。
7. 表皮屈曲促进异位PIN1汇聚和局部生长素最大值，引发突起
PIN1-GFP在屈曲形成前无汇聚；屈曲出现后，PIN1在屈曲末端汇聚，DR5信号增强，随后突起在该处形成。NPA处理后屈曲仍发生但突起受抑制，表明屈曲不依赖PIN1，而突起依赖极向生长素运输。
总结讨论与结论
该研究指出，以往认为异位突起主要由近-远轴极性并置启动；本研究显示，机械屈曲可作为更上游的事件，通过组织应力促进PIN1汇聚并形成生长素最大值，从而启动突起，说明组织力学可反馈调节分子信号。研究也存在局限：as2-7D是功能获得突变体，不能据此推断AS2天然功能；模型为二维截面，杨氏模量参数不能与实验直接比较；渗透处理为间接刚度测量；KRP1过表达具有多效性。研究结论可概括为：分子线索影响组织力学的过程已被较多研究，而组织力学如何影响分子信号仍不清楚；该研究表明，AS2不仅影响组织力学而产生屈曲，屈曲也会反馈到分子信号，促进PIN1-生长素外流转运蛋白汇聚，形成局部生长素最大值，进而触发表皮突起形成。因此，在特定发育情境下，屈曲可促进PIN1汇聚并产生突起。
