《Journal of Fungi》：Time-Course Comparative Transcriptomics Between Isolates of Cercospora zeae-maydis and Cercospora zeina During Maize Infection
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灰斑病（Gray leaf spot, GLS）是玉米的一种主要叶部病害，主要由Cercospora zeae-maydis和Cercospora zeina引起。尽管这两个种均能侵染玉米，但在玉米定殖过程中不同种分离株之间的比较转录程序仍 largely u
灰斑病（Gray leaf spot, GLS）是玉米的一种主要叶部病害，主要由Cercospora zeae-maydis和Cercospora zeina引起。尽管这两个种均能侵染玉米，但在玉米定殖过程中不同种分离株之间的比较转录程序仍 largely unknown。研究人员在受控接种体系下，对分别归属于这两个种的一个吉林分离株在玉米B73定殖过程中的时间进程病原体聚焦RNA测序（RNA-seq）进行了分析。将RNA-seq读段比对到公开的C. zeae-maydis SCOH1-5和C. zeina CMW25467 v3参考基因组，以进行转录本定量和推定功能注释。C. zeae-maydis分离株更早出现可见症状，并在接种后6天（6 days post-inoculation, 6 dpi）表现出更高的病原体来源转录本代表比例。C. zeae-maydis分离株表达的参考注释细胞壁降解酶（cell wall-degrading enzyme, CWDE）相关基因座略多于C. zeina分离株，而表达的候选效应子相关基因座数量相似。C. zeae-maydis分离株还表现出若干CWDE和候选效应子编码基因更早或更强的寄主相关诱导。两个分离株在接种后均表现出与脂质代谢、蛋白酶相关功能和尾孢菌素（cercosporin）生物合成相关的候选转录本诱导，而其中一部分在表达时间或幅度上存在分离株间差异。逆转录定量PCR（reverse transcription quantitative PCR, RT-qPCR）广泛支持了所选候选基因的时间趋势。总之，这些结果定义了玉米定殖过程中两个不同尾孢菌种分离株共享且对比的转录程序。
玉米灰斑病（GLS）是玉米的重要叶部病害，主要由Cercospora zeae-maydis和Cercospora zeina两种近缘真菌引起。已有研究表明，这两个种在地理分布、气候适应性和毒力上存在差异，但此前缺乏在同一接种与分析框架下对代表性分离株进行并排的病原体聚焦转录组比较。植物细胞壁是病原菌入侵的主要物理屏障，真菌需要分泌碳水化合物活性酶（CAZymes）降解细胞壁多糖；同时，Cercospora属真菌具有半活体营养型生活史，在潜伏期分泌效应蛋白抑制寄主免疫，并在后期依赖光激活的尾孢菌素（cercosporin）毒素完成死体营养转变。然而，针对CAZyme、效应蛋白和尾孢菌素生物合成基因在两个种代表性分离株中的时间表达比较仍十分有限。为此，研究人员从中国吉林省采集了分别归属于C. zeae-maydis（CM）和C. zeina（CZ）的两个分离株，通过多基因系统发育确认其分类地位，并在受控接种体系下对玉米B73进行时间进程接种，利用病原体聚焦RNA-seq分析玉米叶片定殖过程中的转录动态。该研究将RNA-seq读段比对到公共参考基因组C. zeae-maydis SCOH1-5和C. zeina CMW25467 v3，结合症状发展、病原体来源转录本比例、差异表达分析、功能注释和RT-qPCR验证，系统比较了两个分离株的转录程序。研究发现，CM分离株在6 dpi时可见症状更早、病原体来源转录本代表比例更高，表达的参考注释CWDE相关基因座略多于CZ，而候选效应子相关基因座数量相近；CM还表现出若干CWDE和效应子编码基因更早或更强的寄主相关诱导。两个分离株均诱导了脂质代谢、蛋白酶相关功能和尾孢菌素生物合成相关候选转录本，但部分基因在表达时间或幅度上存在分离株间差异。RT-qPCR验证了所选候选基因的时间趋势。该研究发表在《Journal of Fungi》，首次在同一受控体系下定义了C. zeae-maydis和C. zeina分离株在玉米定殖过程中的共享与对比转录程序，为后续在更广泛分离株中开展候选致病性基因的功能验证提供了优先基因集。
主要技术方法包括：利用ITS、TEF1、ACT、CAL和HIS3五个基因座进行多基因系统发育分析以确认分离株身份；采用无针注射器辅助接种法在玉米B73三叶期叶片上进行受控接种，于0、1、3、6 dpi采集叶片样本；对混合寄主-病原体样本进行poly(A)富集和Illumina NovaSeq 6000双端测序，使用HISAT2将读段比对到玉米-病原体组合参考基因组，并用featureCounts进行转录本定量；基于参考基因组的OrthoFinder直系同源分组和InterProScan、dbCAN2、EffectorP 3.0等功能注释流程对表达的转录本进行推定功能注释；使用DESeq2进行差异表达分析；最后通过RT-qPCR对代表性CWDE、候选效应子、脂质代谢和蛋白酶相关基因进行独立验证。样本来源为吉林省玉米叶片上的两个分离株，参考基因组来自公共数据库。
在结果部分，3.1节通过多基因系统发育和症状观察确认了CM和CZ分离株的身份，并发现CM在6 dpi时可见坏死面积更大、病原体来源转录本比例（1.67%）显著高于CZ（0.61%），表明CM在该受控体系下症状发展更快。3.2节通过DESeq2差异表达分析，在CM和CZ数据集中分别鉴定出801个和1691个上调的参考注释转录本；GO富集分析显示两个分离株均激活翻译、核糖体、碳水化合物分解代谢和氧化还原等功能，但CM上调转录本更富集于肽/酰胺代谢、ATP代谢和碳水化合物转运，CZ则更富集于碳代谢、能量产生和氧化应激相关功能。3.3节基于dbCAN2注释，检测到CM参考基因座1238个、CZ参考基因座1155个CWDE相关转录本，主要涉及GH、CE、PL家族；CM表达的CWDE相关基因座略多，且部分家族分布存在差异。3.4节通过EffectorP 3.0等预测了候选效应蛋白，保留表达支持后获得333个CM和334个CZ候选效应子相关基因座；多个已知效应子同源物（如Ecp6-like、Ecp2-like、Nis1-like、NPP1-like、PsXEG1-like、SsCut1-like）在CM中表现出更早或更强的寄主诱导表达。3.5节针对尾孢菌素生物合成相关基因，发现CTB1在两个分离株中均有表达，而CTB3、CTB4、CTB5、CTB6和CTB12在CZ中早期即可检测，在CM中则到后期才明显表达；CTB7在两分离株中均表现为后期表达增强，且CZ参考CTB7同源蛋白较短，与既往报道一致。3.6节显示脂肪酸β-氧化和乙醛酸循环相关候选基因（如OG0000035、OG0008358、OG0000374等）在两个分离株中均出现寄主相关诱导，但部分基因（如OG0008389在CM、OG0001749在CZ）表现出分离株偏向性表达。3.7节通过MEROPS注释发现蛋白酶相关转录本涵盖丝氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、金属蛋白酶等类别，其中A1天冬氨酸蛋白酶相关基因（如OG0007758）在体外和0 dpi时低表达，但在寄主条件下强烈诱导。3.8节RT-qPCR验证显示，GH5、GH11、Ecp6-like、NPP1-like等候选基因在CM中于1、3、6 dpi的表达水平高于CZ，脂肪酸β-氧化相关基因和A1天冬氨酸蛋白酶相关基因在3和6 dpi时也表现为CM更高，与RNA-seq趋势总体一致。
讨论部分指出，该研究在单一受控接种体系下同时观察到共享和对比的转录特征。CM更早的症状发展和更强的候选互作转录本表达可能与更快的定殖相关，但这一关联尚不能直接证明因果关系。研究存在四个主要局限：每物种仅分析一个分离株，结果代表分离株相关模式而非种级普遍特征；无针注射器接种绕过了自然气孔侵入过程；0 dpi样本为接种后30分钟采集的接种物相关基线，可能受接种物生理状态影响；病原体来源读段比例不能直接等同于真菌生物量。结论部分总结，该研究建立了参考引导的病原体聚焦时间序列比较，发现CM分离株表现出更快的可见症状发展和6 dpi时更高的病原体来源转录本代表，若干CWDE和效应子相关候选基因在CM中表达更强或更早；两个分离株均激活了碳水化合物和脂质代谢、氧化还原过程、蛋白酶相关功能、分泌和尾孢菌素生物合成相关候选转录本，但部分基因在时间或幅度上存在差异；RT-qPCR支持所选候选基因的时间谱。这些结果将不同的定殖行为与候选寄主互作转录本的时间部署联系起来，并为在扩展分离株集合和独立重复侵染实验中开展功能分析提供了优先基因集。
