人工智能辅助设计的MAGE-A4×CD16 T细胞受体样天然杀伤细胞接合器

《mAbs》：Artificial intelligence-assisted design of MAGE-A4 ×CD16 T-cell receptor-like natural killer cell engagers

　　

癌睾抗原MAGE-A4因在多种恶性肿瘤中高表达且正常组织限制性表达，是具吸引力的免疫治疗靶点。源自胞内MAGE-A4的短肽由HLA-A02:01呈递于细胞表面，可被T细胞受体（TCR）样分子靶向。研究人员通过酵母展示筛选、计算结构优先级排序与实验验证，鉴定出一株识别HLA-A02:01呈递MAGE-A4 GVY230–239肽复合物的TCR样抗体。区别于T细胞接合器，研究人员将该结合分子融合抗CD16重链仅抗体（VHH）可变域，构建为IgG格式天然杀伤（NK）细胞接合器（NKCE）。该MAGE-A4导向NKCE对MAGE-A4+/HLA-A*02:01+肿瘤细胞系表现出强效特异性杀伤。为区分常规Fc介导信号与VHH介导CD16a参与，引入Fc沉默N297A突变；该突变显著降低亲本IgG格式的报道细胞激活，而含VHH的NKCE保留CD16a报道活性。无靶细胞时即可检测报道激活，加入A375细胞后进一步升高。细胞毒试验显示NKCE在体内外模型中介导靶细胞与CD16a依赖的杀伤。结果为MAGE-A4导向NKCE提供体外概念验证，支持包括细胞因子谱、安全性评估与体内疗效在内的进一步临床前评价。

研究背景与立项依据

MAGE-A4属I型癌睾抗原（CTA），在滑膜肉瘤、非小细胞肺癌、食管癌、卵巢癌、头颈癌、膀胱癌及黑色素瘤中高表达，正常组织仅限于睾丸与胎盘，是理想肿瘤免疫靶点。其胞内源短肽经HLA-A02:01（人群频率约40%–50%）呈递形成肽-HLA（pHLA）复合物，可被TCR样抗体识别。然而pHLA界面平坦保守，传统抗体筛选易富集识别HLA框架而非肽段的克隆，单凭亲和力无法区分肽选择性结合与交叉反应，大规模湿实验验证成本高昂。同时，NK细胞无需致敏即可杀瘤，但受免疫抑制微环境、浸润不足与靶细胞抵抗限制。将TCR样特异性与NK细胞重定向结合，有望兼顾靶点广度与安全性。该研究发表于《mAbs》，旨在以AI辅助结构分类前置分流酵母展示文库，获得特异性TCR样抗体，并工程化为Fc沉默、抗CD16a VHH四价接合并肩体（2+4架构）的NKCE，提供MAGE-A4⁺/HLA-A02:01⁺实体瘤治疗候选。

主要关键技术方法

研究人员以GVY-HLA-A02:01–小鼠IgG2a Fc免疫CD-1与Balb/c小鼠建酵母展示scFv库，负选FMN-HLA-A02:01后正选靶抗原，流式获43克隆。计算端采用AlphaFold3预测scFv-pHLA对接，以Discovery Studio 2019统计氢键（≤3.5 ?，角≥120°）与盐桥（≤4.0 ?），ChimeraX算scFv主轴与肽轴夹角，按接触分布分canonical diagonal、biased、nonspecific三类。湿实验端以HEK293F瞬时表达scFv-Fc及NKCE，Protein A纯化；ELISA用生物素化pHLA与CD16a蛋白；流式评细胞结合；T2细胞肽脉冲与丙氨酸扫描证肽依赖；Jurkat-Lucia NFAT-CD16a报道 assay 评Fc沉默与VHH参与；Incucyte S3活细胞成像评PBMC及分选CD3^?CD56⁺ NK细胞毒。样本含中科院细胞库A375、NCI-H1755等及澳门输血服务处去标识PBMC。

研究结果

生成抗HLA-A*02:01/GVY230-239特异性抗体：小鼠免疫后酵母展示库经负/正选，流式证实多数克隆仅结合GVY-pHLA不结合FMN对照，测序去冗余得14鼠源scFv，重组为scFv-Fc表达。

AI辅助建模与结构评估：对15分子AF3对接，8例canonical（含5C4）、4例biased（含5C11）、3例nonspecific（含5C6）；canonical组CDR3入槽与肽形成氢键，biased偏α1螺旋，nonspecific接触非α螺旋框架。

人源化抗体结合特异性实验验证：CDR移植人源化后5C4Hu氢键/盐桥优化、特异增强，5C11Hu丢失肽接触、脱靶上升；ELISA与流式（NCI-H1755、A375、SCaBER、MDA-MB-231、Colo-205、T2脉冲）一致印证。T2丙氨酸扫描示G5、R6为关键接触残基。

NKCE双抗构建与表征：以5C4Hu为骨架，轻链N/C端各接2个抗CD16a VHH（(Gly₄Ser)₃连接），Fc引入N297A；还原SDS-PAGE符合预期，CD法Tm≈55.6℃；流式保留对NCI-H1703/H1755/A375/A375-OVER结合，对PBMC中CD3^?CD56⁺ NK结合阳性，CD16a ELISA表观EC50=0.1625 nM；Jurkat报道assay中亲本IgG有靶细胞时激活，N297A突变抑活，NKCE无靶细胞即有可测激活、加A375进一步升高、抗CD16a阻断下降。

NKCE体外强效抗肿瘤：PBMC效靶比20:1时A375、A375-OVER、NCI-H1755呈浓度依赖杀伤（0.0001–1 nM），MDA-MB-231（HLA-A*02:01⁺/MAGE-A4^?）无杀；无关靶向NKCE（N6、Bike2）10 nM对A375无杀；分选纯化NK细胞效靶比2:1、10 nM NKCE杀A375，抗CD16a阻断显著减弱，证靶与CD16a双依赖。

讨论与结论翻译

讨论指出，研究将“canonical diagonal结合模式”及界面氢键/盐桥分布作为TCR样抗体特异性检查点，5C4在人源化中维持特异而5C11陷“亲和力陷阱”佐证该预测价值；2+4四价抗CD16a配合N297A Fc沉默可避海绵效应与cis激活，多价促CD16a簇集补偿肿瘤面pHLA低密度；局限为仅领先分子入NKCE格式、纯体外模型，未测细胞因子释放，后续需人源化鼠或3D类器官及联用IL-15超激动剂/抗TIGIT等。结论：本研究呈现一例理性设计MAGE-A4 NKCE，融合TCR样识别精度与NK杀机制，凸显AI引导结构分析在抗体药发现价值，为MAGE-A4阳性实体瘤提供高潜力候选。