《Analytica》：Development of a Sensitive Analytical Method for the Determination of Sulforaphane in Vegetables by Automated Online In-Tube SPME/LC–MS/MS
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萝卜硫素（Sulforaphane, SFN）是一种在十字花科蔬菜中含量丰富的异硫氰酸酯，具有公认的抗癌、抗氧化和抗炎特性，并作为膳食化学预防剂受到关注。然而，目前用于食品中SFN定量分析的灵敏且全自动的方法仍然有限。在本研究中，研究人员开发了一种将管内固相微
萝卜硫素（Sulforaphane, SFN）是一种在十字花科蔬菜中含量丰富的异硫氰酸酯，具有公认的抗癌、抗氧化和抗炎特性，并作为膳食化学预防剂受到关注。然而，目前用于食品中SFN定量分析的灵敏且全自动的方法仍然有限。在本研究中，研究人员开发了一种将管内固相微萃取（in-tube solid-phase microextraction, IT-SPME）与高效液相色谱–串联质谱（high-performance liquid chromatography–tandem mass spectrometry, LC–MS/MS）联用的自动化分析系统，用于测定蔬菜样品中的SFN。蔬菜样品在37 °C水溶液中自动水解生成SFN，随后用甲醇通过超声辅助提取。提取液经IT-SPME富集于Carboxen 1006毛细管柱上，在Inertsil C8色谱柱上于5 min内完成分离，并在正电喷雾电离模式下采用多反应监测（multiple reaction monitoring, MRM）进行检测。检测限为5.6 pg/mL，在0.1–100 ng/mL范围内具有良好的线性（R2 = 0.9995），日内和日间精密度分别低于2.9%和3.9%，准确度为98–102%。在西兰花芽、花球和茎中检测到的SFN浓度达到600 μg/g或更高，而在其他 tested 蔬菜中含量不足其十分之一。该方法为蔬菜中SFN的定量分析提供了一种简单、灵敏且节省溶剂的工具，在食品功能性评估和化学预防研究中具有潜在应用价值。
**基于自动化在线IT-SPME/LC–MS/MS的蔬菜中萝卜硫素灵敏分析方法研究解读**
**1. 研究背景与问题**
萝卜硫素（sulforaphane, SFN）是一种来源于十字花科蔬菜的异硫氰酸酯类化合物，大量研究表明其具有抗癌、抗氧化、抗炎、神经保护、抗肥胖及抗菌等多种生物活性，因此在功能食品和临床医学领域受到广泛关注。SFN由前体物质硫代葡萄糖苷（glucoraphanin）在植物内源黑芥子酶（myrosinase）作用下水解生成。当蔬菜被切碎、研磨或咀嚼时，组织破坏使黑芥子酶与底物接触，水解产生SFN。然而，该水解过程受pH、温度、金属离子及辅因子蛋白等因素影响，在酸性条件下或存在特异蛋白和Fe2?时，会生成几乎没有生物活性的SFN腈类衍生物。因此，准确测定蔬菜中SFN含量，需要先优化水解条件以高效生成SFN。
现有SFN分析方法存在诸多不足：气相色谱–质谱联用（GC–MS）因SFN在进样口易热分解而不适合定量；高效液相色谱（HPLC）分离时间长、灵敏度低且易受基质干扰；液相色谱–质谱（LC–MS）及液相色谱–串联质谱（LC–MS/MS）虽具有高选择性和灵敏度，但均需繁琐的样品前处理步骤。传统液液萃取（LLE）需要使用大量有害有机溶剂，且操作复杂、难以自动化；固相萃取（SPE）、分散液液微萃取（DLLME）、QuEChERS等方法虽有所改进，但仍多为多步骤操作，耗时且难以实现全自动化。因此，亟需开发一种简单、快速、灵敏且环境友好的自动化分析方法。
**2. 研究目的与创新点**
研究人员旨在建立一种基于管内固相微萃取（in-tube solid-phase microextraction, IT-SPME）与LC–MS/MS联用的自动化分析方法，用于蔬菜样品中SFN的定量测定。该方法的核心创新在于将样品前处理（萃取、富集）与色谱分离、质谱检测完全自动化耦合，几乎不使用有机溶剂，属于绿色分析技术。系统从样品引入、萃取、富集、分离到数据处理全程自动运行，解决了传统方法预处理繁琐、溶剂消耗大、基质干扰强、灵敏度低和重现性差等问题。
**3. 关键技术方法**
研究采用IT-SPME技术，以Carboxen 1006 PLOT毛细管柱（60 cm × 0.32 mm I.D.）作为萃取装置，通过自动进样器程序控制毛细管清洗、样品溶液吸附富集及流动相洗脱。蔬菜样品经匀浆后，在37 °C蒸馏水中自动水解3小时生成SFN，再用甲醇超声提取两次，合并提取液过滤后加入内标SFN-d8，稀释后直接进样。LC分离采用Inertsil C8-3柱（2.1 × 50 mm, 3 μm），流动相为0.1%甲酸甲醇/水（60:40, v/v），流速200 μL/min。质谱检测采用正电喷雾电离（ESI+）多反应监测（MRM）模式，SFN定量离子对m/z 178→114，定性离子对m/z 178→72，内标SFN-d8定量离子对m/z 186→122。方法验证涵盖线性、检测限、定量限、精密度、准确度及基质效应评估。蔬菜样品包括西兰花芽、西兰花花球、西兰花茎、卷心菜、生菜和水菜，均购自当地市场。
**4. 研究结果与讨论**
**4.1 IT-SPME条件的优化**
研究人员比较了五种不同固定相毛细管柱的萃取效率，包括低极性液相聚硅氧烷柱（Quadrex 007-5）、中等极性柱（CP-Sil 19CB）、高极性聚乙二醇柱（Supelco WAX）、以及多孔吸附剂型PLOT柱（Supel-Q PLOT和Carboxen 1006 PLOT）。结果表明，SFN更易被高极性液相固定相或大表面积PLOT型固定相萃取，其中Carboxen 1006毛细管柱萃取效率最高且峰形良好，故选为萃取装置。考察了抽吸/排出循环次数（5–25次）和流速（50–250 μL/min），发现20次循环后峰面积增长趋缓，综合考虑分析时间选择20次；流速对萃取效率影响较小，为提高通量选择200 μL/min。样品pH在3–8范围内对萃取无显著影响，因此无需缓冲液调节。甲醇含量增加会降低萃取效率，但将样品稀释20倍以上使甲醇含量降至约3%时，萃取率仍可保持80%以上。绝对萃取率仅为15.5%，但内标SFN-d8的萃取率相近（15.1%），且两者RSD均为4.6%，通过峰面积比进行校正后不影响定量。
**4.2 LC–MS/MS分析**
在ESI+模式下，SFN和SFN-d8均表现出良好灵敏度。选择[M+H]?作为前体离子，SFN的定量离子对m/z 178→114和定性离子对m/z 178→72，SFN-d8定量离子对m/z 186→122。优化后的质谱参数与文献报道一致。SFN定量离子和定性离子保留时间均为2.30 ± 0.02 min（n=6），离子比率（定性/定量）为37 ± 2%，确认可用于可靠鉴定。色谱条件经优化后，SFN和SFN-d8分别在2.30和2.27 min处出峰，峰形尖锐且无残留。单个样品总分析时间约20 min，夜间自动运行可每天分析约72个样品，大幅节省人力。
**4.3 方法验证**
在0.1–100 ng/mL浓度范围内，校准曲线方程为y = 0.0323x + 0.0317，相关系数R2 = 0.9995（n=24）。检测限（S/N=3）为5.6 pg/mL，比直接进样法灵敏约50倍，且比文献报道的最灵敏LC–MS/MS法（LOD约50 pg/mL）高9倍以上。灵敏度的提升归因于IT-SPME不仅富集了目标物，还降低了背景噪声。日内精密度（RSD）≤2.9%，日间精密度≤3.9%，准确度为98–102%，表明该方法具有良好的精密度和准确度。
**4.4 蔬菜样品分析**
将方法应用于实际蔬菜样品时，首先需将样品中的硫代葡萄糖苷转化为SFN。研究人员考察了37 °C蒸馏水中水解时间（1–3 h），发现3 h可实现几乎完全水解。甲醇超声提取两次即可回收超过95%的SFN-d8。基质效应评估显示，以卷心菜提取液配制标准曲线与纯水配制标准曲线的斜率之比在绝对校准法和内标法中分别为0.988和0.990，均在0.8–1.2范围内，表明无明显基质抑制或增强效应。SFN-d8在卷心菜提取液中的基质因子为99.7%，进一步证实无基质干扰。食品中SFN的定量限（S/N=10）为7.8 ng/g，加标回收率超过98%。实际样品测定结果显示，西兰花芽和花球中SFN含量较高（≥600 μg/g），卷心菜和生菜含量较低，水菜低于定量限。西兰花花球中SFN含量高于茎，这与硫代葡萄糖苷的分布及黑芥子酶活性差异有关。
**5. 总结与结论**
研究人员成功开发了基于Carboxen 1006 PLOT毛细管的自动化在线IT-SPME/LC–MS/MS方法，用于蔬菜中SFN的测定。与传统方法相比，该方法无需使用氯仿、二氯甲烷、乙酸乙酯等有害有机溶剂，前处理过程绿色环保，且样品前处理与色谱分析实现自动化在线耦合，具有新颖性。检测灵敏度优于已报道的常规方法，并能准确测定多种十字花科蔬菜中的SFN含量。该研究为蔬菜中SFN的定量分析提供了一种选择性好、灵敏度高的可靠工具，预期可应用于功能食品成分评价和质量控制领域。
