《Viruses》：Nipah Virus: A Neurotropic Zoonosis—From Molecular Biology to Clinical Manifestations and Translational Advances
尼帕病毒（Nipah virus, NiV）是一种属于亨尼帕病毒属（Henipavirus）、副黏病毒科（Paramyxoviridae）的单股负链RNA病毒。世界卫生组织已将NiV列为优先病原体，因其具有流行潜力且缺乏充分的应对措施，对公共卫生构成重大风险。在人类中，该病毒引起尼帕病毒病（Nipah viral disease, NVD），其特征为急性呼吸衰竭和/或脑炎。对NVD幸存者的长期评估揭示了持续的神经功能障碍，包括脑病、脑萎缩、高信号病变、眼肌麻痹和肌张力障碍。NiV进入中枢神经系统（central nervous system, CNS）是其发病机制中关键且研究较少的方面之一。NiV迅速靶向鼻甲中的嗅觉上皮细胞，随后感染神经元，从而通过轴突运输扩散至CNS。此外，未成熟树突状细胞的感染与严重的CNS疾病相关，支持血源性播散在神经侵入中的潜在作用。总体而言，理解NiV神经发病机制中的分子机制和宿主因子的作用，对于制定有效的NVD防治策略至关重要。本综述深入探讨了NiV感染的神经致病机制和免疫生物学，以及针对NVD的治疗方式和疫苗的进展。
2. NiV基因组结构
NiV是一种有包膜、非节段、负义单链RNA病毒，属于副黏病毒科（Paramyxoviridae）亨尼帕病毒属（Henipavirus）。病毒颗粒呈多形性，球形至丝状，大小从40到1900 nm不等。其基因组约18 kb，包含六个编码关键结构蛋白的基因：N（核衣壳蛋白）、P（磷蛋白）、M（基质蛋白）、F（融合蛋白）、G（糖蛋白/附着蛋白）和L（大蛋白或RNA聚合酶蛋白）。
两种糖蛋白G和F介导受体依赖性的病毒进入宿主细胞。具体而言，G蛋白胞外域形成同源四聚体，作为病毒附着蛋白与宿主ephrin B2/B3受体结合。F蛋白形成三聚体，介导膜融合。F蛋白最初合成为无活性的前体，需经宿主内体循环区室中的组织蛋白酶L和B进行蛋白水解切割，生成成熟的可融合形式，这是病毒进入所必需的。L蛋白是RNA依赖性RNA聚合酶（RdRp）的催化核心，而P蛋白作为辅因子，与L蛋白相互作用形成RNA聚合酶复合物，对转录和基因组复制均至关重要。N蛋白形成螺旋核衣壳，包裹病毒RNA基因组，并在核衣壳形成过程中与P蛋白相互作用，这是病毒复制的关键步骤。M蛋白协调子代病毒在质膜上的组装和出芽。此外，P基因编码三种非结构蛋白（C、V和W），它们在抑制干扰素（IFN）产生以及调控病毒出芽和新病毒粒子释放方面发挥关键作用。
3. NVD的临床特征
NiV感染可引起从无症状到重症的一系列临床症状。典型表现为流感样症状，包括发热、头痛、咳嗽、呕吐、肌痛、腹部不适、腹泻、胃炎和便秘。发热是最常见症状，其次为头痛，见于65%至88%的NiV感染者。NiV感染还会引起局部血管改变，如人类小血管的血管炎。
尽管NiV-M和NiV-B基因型共享92%的核苷酸同源性，但在患者预后方面存在显著差异。例如，马来西亚和新加坡的研究发现17%至45%的病例为无症状感染，而在孟加拉国暴发期间未报告无症状病例。NiV-B表现出比马来西亚基因型更强的人际传播潜力，后者的人间传播较少。与此一致，NiV-B在动物模型中口腔分泌物中的病毒RNA水平更高，这可能解释了该基因型观察到的人际传播增加现象。
NiV-M感染常始于流感样症状，随后发展为伴有明显炎症和坏死的脑炎，导致严重神经学表现，如意识状态改变和癫痫发作。一项长期神经学研究揭示，NiV-M感染可导致幸存者出现严重神经后遗症，包括持续性抽搐和性格改变。NiV-M的病死率为40%，幸存者中发病率较高。MRI研究显示，急性感染期间大脑皮层下和深部白质中存在小而离散的高信号病灶。这些病灶与炎症、微梗死、坏死和直接神经元感染相关，而迟发型病例则表现为斑片状和大面积融合性皮质病灶，表明复发型与急性病例相比病理过程不同。
NiV-B感染常与非典型肺炎相关，导致严重肺部表现和急性呼吸窘迫综合征（ARDS），病死率达91%。一项关于NiV-B传播的时空研究强调了呼吸道受累在人际传播中的作用。一项分析孟加拉国2001年至2014年248例NiV-B病例的研究指出，呼吸道受累显著增加了死亡率。此外，一项为期14年的监测研究注意到咳嗽和呼吸窘迫是常见表现症状，重症病例中出现ARDS，提示呼吸衰竭是死亡的重要原因。
4. NVD的神经学方面
神经学表现是人类NiV感染的一个标志性特征，通常在疾病后期出现。然而，中枢神经系统（CNS）入侵的机制仍不完全清楚。
在仓鼠模型中，感染后不久即在肺中检测到病毒RNA，但直到感染后第二天才在CNS中发现。此外，仓鼠的实验研究表明，嗅觉感觉神经元和嗅觉上皮细胞对NiV复制更易感，这表明这可能是CNS感染的潜在途径。另外，体外证据表明，血源性播散，包括内皮细胞（ECs）感染和血脑屏障（BBB）破坏，也可能促进病毒进入CNS。此外，NiV感染的树突状细胞可能充当特洛伊木马，帮助病毒穿越BBB。总之，这些发现表明多种机制可能参与CNS感染，但人类中神经入侵的主要途径仍未解决。
人类尸检研究已证明广泛的EC感染，其特征为系统性血管炎和合胞体形成。具体而言，在肺、心脏、肾脏和脑中发现了实质炎症和坏死以及NiV血管炎。此外，血管炎和受感染的EC与血小板激活和血栓形成相关，导致微梗死和脑灰白质中明显的坏死斑块。与病理结果一致，急性NiV感染的MRI结果显示整个大脑中存在小而清晰的离散高信号病灶，这些病灶与血管病变相关。病毒抗原在胶质细胞和室管膜细胞中罕见，但出现在血管病变附近的神经元中，提示血管炎症和BBB破坏可能参与人类的CNS入侵。
迟发型和复发性脑炎患者的首次报告是在1998-1999年马来西亚NVD暴发期间记录的。在马来西亚，5%的个体被发现患有迟发型NiV脑炎，定义为接触NiV十周或更晚后首次出现脑炎。另一方面，复发被定义为从NiV脑炎恢复后神经症状再次出现，在马来西亚9%的病例中出现。复发性和迟发性脑炎显示出相似的放射学、病理学和临床特征。同样，孟加拉国暴发中22名NiV幸存者中的18%显示出迟发性神经体征，如动眼神经异常、眼肌麻痹和颈部肌张力障碍。然而，NiV-B病毒株与复发性脑炎之间的关系需要进一步探索。在急性NiV脑炎幸存者中，66%经历了残留的神经功能缺损。值得注意的是，从接触到迟发性脑炎发作的平均时间为8.4个月，而复发发生的平均时间约为初次脑炎事件后7.6个月。
在病理生理学方面，迟发型或复发性NVD显示神经元和中性粒细胞中均有显著的病毒包涵体，以及以血管病变、脱髓鞘和大面积融合性病变为特征的CNS受累。严重的神经元坏死、胶质增生、血管周围套袖样浸润和炎性浸润均与上述发现一致。然而，有几个问题需要解答，例如：（a）哪些脑细胞支持NiV持续存在？（b）树突状细胞作为潜在的“特洛伊木马”在感染中的作用是什么？（c）NiV-M和NiV-B的神经学效应有何不同？（d）导致复发性或迟发性脑炎的因素有哪些？（e）感染期间脑中炎性介质的作用是什么？（f）人类神经干细胞在感染过程中扮演什么角色？（g）NiV蛋白如何影响中枢神经系统？最后，是否有可能建立复发性脑炎的动物模型？解决这些空白可以显著提高我们对NiV对神经系统影响的理解，可能带来更好的疾病管理策略。
5. NiV的发病机制
最初，NiV的F和G蛋白通过ephrin受体B2和B3（EphrinB2/B3）促进病毒进入细胞。在受感染人类的II型肺泡细胞和支气管上皮等上皮细胞中可鉴定出NiV抗原。因此，受感染的上皮细胞触发呼吸道中炎性细胞因子的产生，激活免疫细胞，最终导致ARDS。研究还观察到来自NiV感染的人呼吸道上皮细胞的炎性介质水平升高，如白细胞介素（IL）-1α、IL-6、IL-8、粒细胞集落刺激因子（G-CSF）和C-X-C基序趋化因子10（CXCL10）。在后期阶段，病毒突破肺ECs，以游离病毒颗粒或附着于宿主白细胞的形式进入血流。这使得病毒能够播散到各种器官，包括脾脏、心脏、肾脏和大脑，导致多器官功能障碍和全身性感染。然而，NiV感染对心脏功能的影响仍知之甚少。
尽管两种主要NiV毒株之间的致病机制大致保守，但已提出其在组织嗜性和病毒复制动力学方面存在差异。NiV-B与更大的呼吸道受累和高效的人际传播相关，而NiV-M暴发主要以神经系统疾病和相对轻微的呼吸道表现为特征。然而，这些临床和流行病学模式的差异是否归因于毒株内在特性尚不清楚，并且没有确凿证据表明NiV-B和NiV-M在感染机制上存在根本差异。因此，需要进一步研究以确定病毒遗传变异、宿主因子以及病毒-宿主相互作用对观察到的差异的贡献。
病毒可能通过两条不同的途径进入CNS：（i）血源性途径，涉及大脑或脉络丛血管；（ii）通过嗅神经的顺行途径。血源性途径始于NiV通过呼吸道进入宿主，导致在呼吸道上皮中进行初步复制。随后，病毒进入血流，导致病毒血症。然后病毒感染包括脑部在内的血管内皮细胞，这是CNS进入的关键步骤。NiV感染还可导致血管炎和EC损伤，损害BBB的完整性。此外，感染期间产生的炎性细胞因子如IL-6、TNF-α、IL-1α、IL-1β和IFN-γ可进一步加剧BBB破坏。此外，NiV可直接感染CNS中的ECs，导致病毒在这些细胞内复制。这种感染可能导致病毒包涵体的形成，促进病毒进入脑实质。另一种潜在机制涉及白细胞将NiV转运穿过BBB，由CNS中趋化因子如CXCL10表达增加介导，从而促进病毒的神经侵入。血源性途径被认为是NiV-B和NiV-M共同的CNS入侵机制，尽管与NiV-B相关的更高呼吸道病毒载量可能增强全身性播散。
对于顺行途径，NiV首先靶向并感染鼻甲中的嗅觉上皮。与此相关，一项体内仓鼠模型显示，NiV可以在3天内从鼻上皮沿嗅神经迅速扩散到脑的嗅球。研究还表明，NiV利用轴突运输从受感染的嗅觉神经元通过其轴突移动。这为病毒进入CNS提供了一条直接途径，无需穿越BBB。一项涉及NiV感染猪的早期研究表明，除了直接从血液穿越BBB外，病毒还可以通过包括嗅神经在内的颅神经进入CNS。从嗅球开始，NiV扩散到嗅结节，然后病毒播散到整个腹侧皮层和侧脑室邻近区域。在大脑内，病毒进一步感染神经元和胶质细胞，导致血管损伤和以坏死、疏松、海绵样变性、小胶质细胞增生和脑炎为特征的神经症状。这最终导致过度炎症反应加剧，进一步损害血管内皮完整性。重要的是，NiV通过此途径进入CNS与呼吸道疾病的发生同时发生，表明初始CNS进入是同时发生的，而非通过全身性病毒复制顺序发生。虽然这一机制在实验性NiV-M模型中已得到充分证实，但仍需进一步研究以确定类似的神经侵入动态是否发生在NiV-B中，并阐明两种基因型间临床表现差异的分子基础。未来，研究还应解决脑中炎性介质的主要来源、受感染树突状细胞的作用以及区分复发性和/或迟发性脑炎的确切机制。
6. NiV的免疫逃逸
先天免疫系统似乎对控制NiV感染至关重要。一项早期体外研究报告支持这一点，该报告显示NiV感染在受感染的ECs和气道上皮细胞中触发I型干扰素（IFNα/β）和促炎细胞因子的产生。一项体内模型强调，野生型小鼠对NiV具有抵抗力，而敲除I型IFN受体的小鼠则死于该病。这一证据表明IFN反应能自然抑制NiV复制，限制病毒感染和传播。
由NiV P基因编码的非结构蛋白（V、W和C）充当干扰素拮抗剂。机制上，NiV V蛋白可通过阻止UBXN1蛋白被蛋白酶解以及抑制维甲酸诱导基因I（RIG-I）和相关解旋酶受体（MDA-5）来抑制IFN-β的产生。这稳定了MAVS和泛素结合UBA结构域/UBX基序UBXN1，导致免疫应答失调，促成NiV的病理生理学和复发性脑炎。此外，它还通过与STAT2结合干扰JAK-STAT信号传导，从而阻断IFNα/β信号转导，而W蛋白定位于细胞核并隔离STAT1，阻断IFN诱导的基因表达。类似地，C蛋白已被证明通过干扰IKKα阻断TLR7/TLR9激活，从而阻止IRF7激活。与此相关，Satterfield等人显示，雪貂中缺失W和C基因导致较轻的临床表型；然而，这些缺失并未显著降低高死亡率，并且仍然与神经并发症相关。此外，M蛋白与泛素连接酶TRIM6相互作用并使其降解，阻止了IKKε的泛素化，而IKKε的泛素化是IRF3和STAT1磷酸化的必需过程。这损害了IFN的产生和信号级联反应，表明NiV的先天免疫逃逸触发了过度炎症状态，而不是控制病毒复制。Sugai等人概述了N蛋白在阻碍STAT1核转运中的关键作用，从而提出了一种副黏病毒展现的开创性IFN拮抗方法。因此，使用体外或体内方法进行宿主-病毒相互作用研究可以为NiV介导的细胞相互作用以及免疫逃逸机制提供一些线索。
7. NiV诊断现状
用于诊断NiV的常用实验室检测包括实时PCR以检测病毒基因组和酶联免疫吸附测定（ELISA）以检测病毒特异性抗体。用于检测NiV RNA的传统方法是半巢式或巢式逆转录酶PCR（RT-PCR）。该方法被采用来检测蝙蝠尿液中的NiV，最低检测限为0.37 pg/μL总RNA。第一个用于检测NiV的实时RT-PCR是基于N基因保守区的扩增开发的。利用这项技术，Zoologix创建了一个商业试剂盒，可识别血清、血液、受感染动物组织或脑脊液中的NiV。最近，基于逆转录重组酶等温扩增方法与侧流层析相结合，开发了三种用于检测NiV的快速分子检测方法。值得注意的是，已经开发出一种宏基因组方法来检测生物样本中的NiV，灵敏度为21个基因组/反应。
ELISA用于测量抗体反应。最初，使用源自NiV感染细胞的伽马射线灭活NiV抗原来鉴定人类中的NiV抗体。后来，基于单克隆抗体技术的NiV N蛋白捕获ELISA出现，以区分NiV和HeV。Yu等人开发了一种使用重组NiV-N蛋白的ELISA，其敏感性和特异性分别为91.7%和91.8%。Kashiwazaki等人建立了一种固相阻断ELISA用于检测抗NiV抗体。此外，一种用于IgG的间接ELISA可检测猪血清中针对截短可溶性HeV G或NiV G蛋白的抗体的存在。有趣的是，微球测量法已被用于测定反刍动物（包括牛、山羊和猪）血清中针对糖蛋白（NiVs G）的抗体。
先进技术，包括CRISPR/Cas、纳米孔测序、等离子体检测和无提取核酸检测设备，正在被探索用于检测包括NiV在内的几种致病病毒。
8. NiV感染的治疗方法
目前，尚无获批的治疗NiV感染的方法。尽管如此，单克隆抗体和抗病毒药物已在临床前模型中进行了研究，并显示出有希望的结果。
(a) 单克隆抗体
一种名为m102.4（一种抗HeV糖蛋白抗体）的人类单克隆抗体（mAb）通过特异性靶向病毒糖蛋白G上ephrin-B2和ephrin-B3受体结合位点中的一个表位，显示出针对HeV和NiV的强大交叉中和反应。在用不同亨尼帕病毒（NiV-B、NiV-M和HeV）攻击的动物（雪貂和非人灵长类）中，当以恒定剂量注射时，该mAb显示出保护效力。值得注意的是，m102.4的首次人体剂量递增研究也未显示任何严重不良事件或免疫原性反应的证据。2018年印度的一份暴发报告描述了接受m102.4作为暴露后预防的NiV感染患者，但未提供疗效数据。
小鼠mAb 5B3的人源化版本在雪貂模型中显示出针对NiV-M、NiV-B和HeV的交叉保护性。小鼠mAb mAb1F5和12B2抑制病毒进入，而其人源化版本（h1F5和h12B2）在NHP模型中对NiV-M、NiV-B和HeV表现出更高的抑制浓度。Dong等人记录了人mAbs HENV26和HENV32可以通过EphB2/3受体阻断NiV-B与宿主细胞的结合。同样，另一组抗HeV受体结合蛋白抗体（HENV 103和HENV 117）联合使用可完全保护仓鼠免受NiV-B的攻击，但单独使用时无效。
(b) 小分子化合物
小分子代表了治疗NVD的一种有前景的治疗策略。这些化合物具有口服生物利用度、易于合成和广谱抗病毒活性的潜力等优点。它们靶向病毒生命周期的各个阶段，包括进入、复制和宿主-病原体相互作用。已有几种候选药物显示出对NVD的临床前和临床疗效。在动物研究中，腹腔内或皮下给予利巴韦林可延迟感染NiV-M的仓鼠和感染HeV的非洲绿猴的症状出现和死亡。同样，感染NiV-M的仓鼠接受法匹拉韦治疗后存活并康复，尸检时未显示任何临床症状、可检测到的病理变化或病毒抗原。与此一致，核苷类似物瑞德西韦在以10 mg/kg/天的剂量从第1天开始给药时，对非洲绿猴具有保护作用。保护效力似乎依赖于早期治疗，因为在初次攻击后3天才开始治疗时仅提供部分保护。此外，利巴韦林作为一种老药新用的类似物前药，已被用于治疗NVD，展示了其临床有效性。
另一方面，NiV对广谱变构副黏病毒抑制剂GHP-88309表现出天然耐药性。最近的冷冻电镜分析揭示，耐药性是由于NiV L聚合酶中一个独特的组氨酸残基（H1165）破坏了抑制剂结合口袋，阻止了有效的药物结合。这一结构特征将NiV与其他易感的副黏病毒区分开来，并强调了未来NiV治疗药物开发中结构引导抗病毒设计的重要性。
9. NiV感染的疫苗策略
为了开发有效的NiV疫苗，已经测试了不同的方法。第一个突破是通过亚单位疫苗方法实现的，该方法使用病毒糖蛋白的一部分来刺激保护性免疫反应。例如，Mungall等人观察到，对急性NiV感染的猫模型施用基于可溶性糖蛋白的亚单位疫苗，可介导长达2个月的强烈抗体反应。类似地，HeVsG，一种HeV的亚单位糖蛋白，在预防疾病表现和病毒复制方面表现出色。此外，它在接种疫苗的雪貂模型中提供了长达14个月的保护。相比之下，接种HeVsG的猪产生了针对NiV的交叉中和抗体，但未受到保护。另一方面，值得注意的是，用HeVsG免疫的非洲绿猿显示出对NiV感染的保护作用，表现为高水平的NiV特异性中和及交叉反应性IgG抗体。由于这种优异的效力，该亚单位疫苗后来被开发并批准用于澳大利亚的马匹（Equivac）。目前，该疫苗的安全性和免疫原性正在一项I期临床试验中进行测试。
其他各种疫苗平台，如病毒载体疫苗、抗病毒疫苗、嵌合疫苗、mRNA疫苗、DNA疫苗和病毒样颗粒（VLP）疫苗，正在开发中，用于有效管理NiV感染。值得注意的是，流行病防范创新联盟（CEPI）正致力于生产NiV疫苗，由学术界和工业界的团队开发了四种有希望的尼帕疫苗候选物。它们是：（i）HeV-sG-V，一种由Auro Vaccines和PATH支持的重组亚单位疫苗，采用两剂方案，已成功完成I期试验；（ii）PHV02，一种由Public Health Vaccines支持的表达NiV G蛋白的VSV载体疫苗，已完成I期试验并正在推进至II期；（iii）一种由东京大学支持的麻疹病毒载体疫苗，正在孟加拉国进行I期和II期临床研究；（iv）牛津大学支持的ChAdOx1载体NiV-B疫苗，正在孟加拉国进行II期测试。此外，CEPI还与孟加拉国和马来西亚的机构合作，研究不同毒株间的NiV遗传多样性，以及了解NVD幸存者的免疫反应。
10. 结论
WHO和CEPI将NiV列为优先病原体，因为其高死亡率、大流行传播风险以及缺乏获批准的防控措施。不同动物模型的开发为NiV发病机制提供了宝贵的见解，并增进了我们的理解。然而，一些关键的分子机制需要进一步研究，例如：（i）NiV靶向并感染CNS的确切途径；（ii）宿主细胞因子在神经学表现中的作用；（iii）NiV介导的神经学后果的长期影响，包括持续性感染、复发和迟发性疾病；（iv）现有和即将推出的疫苗以及针对复发性或迟发性NiV脑炎的治疗策略的有效性、持久性和安全性。
解决这些空白需要持续改进动物模型，包括开发更接近再现人类NVD神经病理学和免疫反应的模型。此外，研究应考虑与使用先进动物模型（特别是人源化模型和NHP）相关的伦理和监管挑战。同时，并行努力开发和评估安全有效的疫苗和治疗药物，对于改善NiV暴发的准备工作和降低疾病相关死亡率仍然至关重要。
此外，研究人员应使用结合计算生物学、结构生物学和生物信息学的新方法，以助于特异性和免疫原性防控措施的设计。此外，基于假病毒的系统提供了一种替代性的经济有效的方法，可用于未来的抗病毒药物和疫苗评估研究。最终，整合不同策略和新技术对于理解NiV发病机制以及加快疫苗候选物从实验室到实际应用的转化进程至关重要。
