《Biology》：Preliminary Identification and Characterization of Antimicrobial Peptides from the Skin of Rana amurensis Based on Transcriptome Sequencing
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黑龙江林蛙（Rana amurensis）的皮肤是对抗微生物侵袭的重要防御屏障，但其皮肤免疫防御的分子基础及抗菌肽（antimicrobial peptide, AMP）库仍未完全阐明。本研究中，研究人员建立了嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophi
黑龙江林蛙（Rana amurensis）的皮肤是对抗微生物侵袭的重要防御屏障，但其皮肤免疫防御的分子基础及抗菌肽（antimicrobial peptide, AMP）库仍未完全阐明。本研究中，研究人员建立了嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）感染后黑龙江林蛙的皮肤转录组图谱，并整合转录组学与生物信息学方法，以表征转录应答并鉴定候选AMP。在未感染组与感染组之间共鉴定出1669个差异表达基因（differentially expressed gene, DEG），其中1091个上调、578个下调。嗜水气单胞菌感染诱导了先天免疫相关基因与通路的显著转录变化，包括与Toll样受体（Toll-like receptor, TLR）信号通路相关基因的差异表达。基于转录组的筛选鉴定出151条候选AMP序列。根据序列特征、进化保守性及理化性质（长度≤50个氨基酸，净电荷为+2～+9），选出6条候选序列，其中随机选取的3条经化学合成后显示出对细菌病原体的抗菌活性，且在64 μg/mL浓度下诱导的溶血率低于10%，L929细胞活力维持在79%以上。这些结果表明，嗜水气单胞菌感染可诱导黑龙江林蛙涉及先天免疫相关通路及多种候选AMP的协同转录应答。本研究支持转录组引导的发现策略在两栖动物候选AMP鉴定中的实用性，并为理解黑龙江林蛙皮肤防御的分子基础提供了见解。
两栖动物皮肤作为抵御病原微生物的重要屏障，其免疫防御机制一直是进化免疫学的研究热点。黑龙江林蛙（Rana amurensis）是分布于东北亚高纬度地区的冷适应两栖动物，长期接触复杂水生环境中的微生物。由嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）引起的红腿病是威胁蛙类种群的主要传染病之一，具有传播快、致死率高的特点。以往研究通过传统分子克隆和测序方法从该物种皮肤中鉴定出若干抗菌肽（antimicrobial peptide, AMP）家族，但这些方法难以全面揭示AMP多样性及其在病原感染下的表达动态。因此，该研究采用转录组测序结合生物信息学筛选的策略，系统分析黑龙江林蛙皮肤在嗜水气单胞菌感染后的转录应答，并挖掘候选AMP。该研究论文发表于《Biology》期刊。
研究人员自中国黑龙江省哈尔滨市某市场购入60只健康成年雄性黑龙江林蛙，取其中6只随机分为对照组（n=3）和感染组（n=3）。感染组以10
6 CFU/mL的嗜水气单胞菌悬液浸泡36 h并施加温和电刺激诱导皮肤分泌，对照组以生理盐水相同处理。提取皮肤总RNA后构建cDNA文库，在Illumina平台进行双末端测序。生物信息学分析包括Trinity组装、GO/KEGG富集、DESeq2差异表达分析；候选AMP通过TransDecoder、SignalP、CAMPR3/DRAMP同源搜索及CS-AMPPred机器学习筛选，并结合引物筛查。合成3条候选肽后，采用纸片扩散法、微量肉汤稀释法测定抗菌活性，并评估溶血率与L929细胞毒性。
3.1 样本采集与RNA质量评估
在感染过程中未观察到死亡或可见皮肤感染迹象，每组各取3只蛙的皮肤组织提取RNA，经Agilent 2100质检符合测序要求。
3.2 转录组测序与组装
Illumina HiSeq 4000测序获得1.3697亿条高质量clean reads，Q20>97%、Q30>92%。从头组装得到178,381条转录本和91,313条unigenes，N50分别为2065 bp和1517 bp。读段随机性和饱和度分析表明测序深度足够。
3.3 功能注释与分类
共255,751条转录本与KOG、KEGG、Nr、GO、Swiss-Prot数据库比对，其中41,664条注释到Nr，16,987条匹配Swiss-Prot。
3.4 基因富集分析
15,884条unigenes获得GO注释；COG分类显示多数unigenes属于“一般功能预测”；KEGG通路分析将12,235条unigenes映射到34条通路，免疫系统类别含2320条unigenes，仅次于信号转导。AMP相关基因GO富集显示“防御反应”“细菌防御反应”“先天免疫应答”等8个生物学过程显著富集（FDR<0.05）。
3.5 编码序列预测与差异表达分析
TransDecoder预测CDS长度集中在300–400 bp。差异表达分析共鉴定出1669个差异表达基因（DEGs），其中1091个上调、578个下调。多个免疫相关DEGs被识别，包括细胞因子、模式识别受体、补体成分和AMP编码基因。白细胞介素-32显著上调（log
2FC=1.90, q=0.027）；Toll样受体信号通路中MAP2K7、JUN、TLR13为DEGs。AMP相关DEGs共6个，包括β-防御素、Ocellatin、Brevenin、Amurin-3前体、Amurin-6AM和β-防御素136。
3.6 抗菌肽的鉴定与筛选
结合HMM搜索、同源比对和模式匹配，从36,861条含信号肽的CDSs中筛选候选AMP。CAMPR3 HMM搜索得45条，DRAMP同源比对得67条，模式匹配得68条；合并去冗余后得171条，经CS-AMPPred机器学习验证得到79条高置信度候选；另通过信号肽保守区引物筛查获得72条，合计151条候选AMP序列。
3.7 抗菌肽的系统发育分析与理化特性表征
系统发育分析显示，151条预测序列中55条（36.4%）与已知两栖AMP家族（如Amurin-6AM、Esculentin-1B）聚簇，96条（63.6%）形成未表征新分支。合并筛选后得到90条非冗余成熟AMP序列。按长度≤50个氨基酸、净电荷+2～+9的标准选出6条（T2、T17、T19、T26、T62、T74），它们富含脯氨酸、半胱氨酸、甘氨酸，分子量3337.89–5492.60 Da，等电点8.63–9.88，呈阳离子特性。稳定性预测显示T62体内半衰期>10 h，T74和T2可能热稳定。
3.8 合成肽的抗菌活性
随机合成T2、T19、T26。纸片扩散法显示三条肽对革兰氏阴性菌（E. coli、Salmonella sp.、A. hydrophila）均有抑菌圈，仅T19对金黄色葡萄球菌有抑菌圈。MIC测定：T19和T26对E. coli的MIC均为64 μg/mL（T2为512 μg/mL）；T26对Salmonella sp.的MIC为64 μg/mL；T2对A. hydrophila的MIC为64 μg/mL；仅T19对S. aureus有活性（MIC=64 μg/mL）。
3.9 合成肽的溶血与细胞毒性活性
溶血实验显示三种肽溶血活性呈浓度依赖性，在512 μg/mL时溶血率分别为T2 26.33%、T19 32.65%、T26 17.54%；128 μg/mL以下均<13%。CCK-8实验显示细胞活力随浓度降低，512 μg/mL时T2、T19、T26分别降至24.07%、12.85%、20.91%；32 μg/mL时均>80%。统计显示T19溶血和细胞毒性最强，T26溶血最低。
讨论部分指出，两栖动物皮肤不仅是物理屏障，还通过颗粒腺分泌AMP等生物活性分子参与免疫调节。本研究观察到黑龙江林蛙皮肤在嗜水气单胞菌感染后富集免疫相关生物学过程，且TLR信号通路相关基因差异表达，提示皮肤主动参与抗菌防御。转录组引导的筛选策略较传统克隆方法能更全面地捕获AMP多样性，鉴定出的151条候选序列中大部分为新候选。但研究存在局限：仅合成3条候选肽、未与已知AMP平行比较、仅单一时间点取样等。结论部分：本研究利用转录组图谱表征了黑龙江林蛙皮肤对嗜水气单胞菌的免疫应答，感染诱导了先天免疫相关基因和通路的显著转录变化；鉴定出151条候选AMP序列，其中3条合成肽均对至少一种测试菌有抑制活性。这些结果扩大了该物种的候选AMP库，为两栖动物宿主防御和天然AMP发掘提供了资源。
