中国长吻鮠（Leiocassis longirostris）PFK基因家族的适应性进化

《Biology》：Adaptive Evolution of the PFK Gene Family in Chinese Longsnout Catfish, Leiocassis longirostris

　　

中国长吻鮠是一种典型的肉食性鱼类，其利用葡萄糖的能力相对较弱。然而，其葡萄糖代谢适应的基因组基础仍不清楚。在本研究中，研究人员采用比较基因组学方法，系统分析了中国长吻鮠葡萄糖代谢相关基因的进化特征，重点关注基因家族进化、扩张与收缩模式以及选择压力。结果表明，葡萄糖代谢相关基因在进化过程中经历了显著重塑。参与葡萄糖消化、吸收和胰岛素信号通路的基因表现出收缩趋势，而与蛋白质和脂质代谢相关的基因则表现出扩张趋势。这一模式与该物种长期适应高蛋白、高脂肪饮食一致。比较分析进一步揭示，与不同食性的鱼类相比，中国长吻鮠中参与糖酵解的某些关键基因拷贝数减少。分子进化分析显示，参与糖酵解和糖异生的关键基因（包括己糖激酶2（hk2）、磷酸果糖激酶肌型/血小板型（pfkm/p））表现出加速进化或正选择迹象。值得注意的是，PFK基因家族表现出基因收缩、快速进化和正选择共同作用所产生的复杂进化特征。总之，本研究揭示了中国长吻鮠葡萄糖代谢适应的基因组进化基础，并确定了PFK基因家族是阐明其独特葡萄糖代谢特征的关键候选基因。

论文解读：中国长吻鮠PFK基因家族的适应性进化与葡萄糖代谢适应

一、研究背景与科学问题

硬骨鱼类通常被认为具有葡萄糖不耐受的特性，与陆生哺乳动物相比，它们在摄食后常表现出持续性高血糖。然而，不同硬骨鱼类谱系之间的葡萄糖不耐受程度存在显著差异，这表明葡萄糖代谢在不同鱼类中经历了不同的进化路径。草食性和杂食性鱼类能够迅速恢复葡萄糖稳态，表现出相对较强的葡萄糖利用能力；而肉食性鱼类则表现出较差的葡萄糖耐受性，其典型特征是在摄入葡萄糖或高碳水化合物食物后，血糖水平出现显著且持续性的升高。中国长吻鮠（Leiocassis longirostris）属于鲇形目（Siluriformes）鲿科（Bagridae），是一种典型底栖肉食性鱼类，长期适应低碳水化合物饮食环境，对膳食碳水化合物的利用能力有限，表现为高碳水化合物饲喂后持续性高血糖和肝脏脂质积累。然而，目前对于肉食性硬骨鱼类葡萄糖代谢适应的遗传基础和进化机制仍缺乏系统认识。

已有研究表明，糖酵解和糖异生是分别调控葡萄糖利用和生成的核心代谢通路，二者之间的平衡影响生物体处理外源葡萄糖的能力。草食性鱼类在摄食后能快速诱导关键糖酵解酶的表达，而肉食性鱼类对碳水化合物的糖酵解反应有限；同时，肉食性鱼类在高碳水化合物摄入后，肝脏糖异生不能有效被抑制，导致内源性葡萄糖持续产生。近年来比较基因组学研究表明，代谢通路的适应性进化与基因家族扩张、收缩及正选择密切相关。然而，哪些编码限速酶的基因与葡萄糖代谢适应相关，以及塑造这些基因的进化机制在很大程度上仍属未知。

二、研究内容与主要结论

针对上述科学问题，研究人员构建了涵盖从软骨鱼类外群到具有不同食性的硬骨鱼类的多物种比较框架，聚焦中国长吻鮠的葡萄糖代谢适应，系统分析了糖酵解和糖异生通路相关基因的进化模式。研究整合了基因家族聚类分析、系统发育重建、基因家族扩张与收缩分析、选择压力评估等多种比较基因组学方法，并结合基因结构分析、保守结构域注释、蛋白基序鉴定和种间共线性分析，深入探究了候选基因家族的结构特征。

研究结果表明，中国长吻鮠葡萄糖代谢相关基因在进化过程中经历了显著重塑。KEGG富集分析显示，碳水化合物消化吸收、胰岛素信号通路及其下游PI3K-Akt信号通路、胰高血糖素信号通路在鲇形目谱系中显著收缩，而泛素介导的蛋白水解和脂肪消化吸收等蛋白质与脂质代谢相关通路则表现出扩张。这一进化特征与中国长吻鮠长期适应高蛋白、高脂肪饮食的肉食性营养策略一致。比较基因组学分析进一步表明，与草食性鱼类相比，中国长吻鮠中多个关键糖酵解基因（包括pfkm、pfkp和tpi）拷贝数减少。分子进化分析鉴定出五个快速进化基因（hk2、pfkm、pck、pc、g6pc）和五个正选择基因（hk2、pfkp、pkm、pck、gapdh）。值得注意的是，PFK基因家族是唯一同时表现出基因家族收缩、快速进化和正选择信号的关键限速酶基因家族，这一独特的进化模式——基因拷贝数减少但保留拷贝在正选择下加速进化——表明PFK是研究中国长吻鮠葡萄糖代谢适应的关键候选基因家族。

该研究揭示了肉食性鱼类葡萄糖代谢适应的多层进化模式，为理解硬骨鱼类糖代谢多样性的基因组基础提供了新见解，也为肉食性鱼类养殖中膳食碳水化合物水平的优化提供了理论依据。论文发表在《Biology》。

三、主要关键技术方法

本研究采用了多种比较基因组学方法。研究样本包括七种代表性脊椎动物：草鱼（Ctenopharyngodon idella）、团头鲂（Megalobrama amblycephala）、中国长吻鮠、黄颡鱼（Tachysurus fulvidraco）、斑马鱼（Danio rerio）、小体鲟（Acipenser ruthenus）和象鲨（Callorhinchus milii），覆盖肉食性、草食性、杂食性鱼类及外群。关键技术包括：基于OrthoFinder的直系同源基因聚类；基于最大似然法的系统发育重建和贝叶斯松散分子钟的分歧时间估计；基于CAFE5的基因家族扩张收缩分析；基于PAML软件包中枝模型和枝位点模型的选择压力分析，分别鉴定快速进化基因和正选择基因；AlphaFold3预测蛋白三维结构并进行正选择位点结构定位；基于MCScanX的共线性分析；MEME基序预测与NCBI Batch CD-Search保守结构域分析。

四、主要研究结果

（一）系统发育关系与进化时间线

基于七种代表性脊椎动物全基因组数据构建了时间校准系统发育树。系统发育分析显示，包含团头鲂、草鱼和斑马鱼的鲤科鱼类形成高支持率分支，与包含黄颡鱼和中国长吻鮠的鲇形目谱系约在1.5352亿年前分化。草鱼与团头鲂的分歧时间约为1319万年前，中国长吻鮠与黄颡鱼的分歧时间约为1746万年前。

（二）基因家族扩张与收缩分析

全基因组基因家族进化分析揭示了不同鱼类谱系特异性的基因家族扩张和收缩模式。中国长吻鮠表现出相对较高比例的收缩基因家族。KEGG富集分析显示，鲇形目谱系中碳水化合物消化吸收、胰岛素信号通路、PI3K-Akt信号通路及胰高血糖素信号通路显著收缩，而泛素介导的蛋白水解和脂肪消化吸收等通路扩张，表明中国长吻鮠在基因组水平上发生了倾向于利用膳食蛋白质和脂质而非碳水化合物的代谢特化。

（三）葡萄糖代谢相关基因拷贝数进化

对糖酵解和糖异生通路中18个核心基因的拷贝数热图分析显示，草食性鱼类（草鱼和团头鲂）保留了多个关键糖酵解基因拷贝，包括pfkm、pfkp和eno1/2/3，且aldo扩张至五个拷贝；相比之下，肉食性鱼类（中国长吻鮠和黄颡鱼）中pfkm、pfkp和tpi等关键糖酵解基因发生收缩，通常仅保留单拷贝。草食性鱼类糖酵解基因的扩张和保留与其较高的碳水化合物利用能力一致，而中国长吻鮠中拷贝数的减少可能在其基因组水平上导致了葡萄糖不耐受和肉食性代谢特化。

（四）葡萄糖代谢通路快速进化基因鉴定

枝模型选择压力分析以中国长吻鮠为前景分支，鉴定出五个快速进化基因。在糖酵解通路中，催化葡萄糖代谢第一步的hk2表现出强烈的加速进化信号，关键限速酶基因pfkm的ω值在前景分支显著高于背景分支。在糖异生通路中，pck、pc和g6pc同样表现出显著的进化速率加速信号。这些结果表明核心葡萄糖代谢组分经历适应性序列进化，可能与中国长吻鮠物种特异性的葡萄糖不耐受代谢适应相关。

（五）葡萄糖代谢基因正选择与适应性位点

枝位点模型分析表明，pfkp、pkm、pck、hk2和gapdh五个基因在中国长吻鮠谱系中具有显著正选择信号。BEB分析鉴定出多个高后验概率的正选择位点：hk2包含多个正选择密码子（如126W、127G、132C），pfkp包含三个正选择位点（250S、266G、272S），pkm和pck分别检测到单一正选择位点。在所有分析的代谢基因中，PFK是唯一同时表现出基因家族收缩、正选择和快速进化的限速酶基因家族。

进一步对PFKP正选择位点进行三维结构定位分析，通过AlphaFold3预测的蛋白结构具有极高的整体可靠性（pTM=0.95），三个正选择位点均位于N端催化结构域（残基1–399）内，其中273位残基参与底物结合，位于寡聚化关键亚基界面；257和279位残基则位于三个互不连通的表面沟槽中。这些位点的局部化学环境显示Ser257和Ser279与邻近残基形成极性相互作用和氢键网络，而Gly273位于缺乏固定二级结构的柔性环区。

（六）PFK基因家族系统发育与共线性分析

系统发育和微共线性分析显示，PFK基因家族清晰分为三个分支：pfkp、pfkl和pfkm。在硬骨鱼类谱系中，pfkl分支在硬骨鱼特异性基因组复制事件后进一步分化出pfkla和pfklb两个旁系同源亚家族。中国长吻鮠中pfkm和pfkp保留为单拷贝，而pfkl维持两个拷贝。共线性分析显示，含有pfkm和pfkl的染色体区域在三种鱼类中高度保守，但中国长吻鮠的pfkp位点位于缺乏对应共线性连接的基因组区域，表明该基因可能经历了谱系特异性的基因组重排或位点重定位。PFK基因家族在中国长吻鮠谱系中的进化历史不仅表现为硬骨鱼全基因组复制衍生旁系同源物的不对称丢失，还伴随pfkp位点的谱系特异性重定位。

（七）PFK家族基因结构特征

对PFK基因家族的外显子-内含子组织、保守基序和功能结构域进行比较分析，结果显示所有PFK成员均表现出高度保守的结构特征。十个保守基序的组成和排列在物种间完全一致，所有PFK均包含完整的约800个氨基酸的PFK结构域。这表明中国长吻鮠的PFK维持了PFK家族的典型结构特征，没有发生明显的保守结构域丢失或退化。在外显子-内含子组织层面，不同PFK亚型表现出不同的基因组组织模式，pfkp亚型总体上比pfkl和pfkm具有更大的基因组跨度，差异主要源于内含子长度变异。

五、讨论与结论

本研究表明，中国长吻鮠的葡萄糖代谢适应是多层次进化事件共同作用的结果：涉及葡萄糖代谢相关通路基因组成的改变、关键基因拷贝数的变化以及PFK基因家族的适应性进化。与草食性鲤科鱼类相比，中国长吻鮠在代谢通路和基因拷贝数层面均表现出谱系特异的进化模式。PFK基因家族收缩和正选择的组合进化特征，特别是在硬骨鱼全基因组复制后pfkm和pfkp旁系同源物的不对称丢失，以及pfkp位点的基因组重定位，提示PFK家族在肉食性鱼类的葡萄糖代谢适应中扮演了关键进化靶点的角色。这些候选适应性位点也为肉食性鱼类养殖中优化膳食碳水化合物水平和代谢调控提供了理论基础。然而，本研究主要依赖比较基因组学方法探索代谢差异，未来仍需通过体外酶活测定和基因编辑等手段进行功能验证，并整合更广泛的硬骨鱼类基因组数据以全面解析膳食碳水化合物利用的遗传基础。

综上所述，本研究揭示了中国长吻鮠葡萄糖代谢适应的基因组进化基础，PFK基因家族作为连接基因组进化变化与葡萄糖代谢特征的重要候选基因，加深了研究团队对中国长吻鮠及其他肉食性硬骨鱼类糖酵解适应基因组基础的理解，同时为水产养殖中膳食碳水化合物利用的优化提供了理论支撑。