植物源水提物作为杜氏盐藻（Dunaliella salina）生长的生物基调节剂用于可持续培养

《Fermentation》：Plant-Derived Aqueous Extracts as Bio-Based Modulators of Dunaliella salina Growth for Sustainable Cultivation

　　

本研究评估了姜黄（Curcuma longa）、薄荷（Mentha sp.）、葡萄皮（Vitis sp.）和芒果皮（Mangifera indica）的水提物对微藻杜氏盐藻（Dunaliella salina）生长及总类胡萝卜素含量的影响。采用两阶段培养策略，将通过煎煮法制备的水提物以0.5%（v/v）的浓度在接种时或指数生长阶段后添加。微藻生长通过直接细胞计数监测，总类胡萝卜素含量通过分光光度法在收获的生物质中测定。提取物的化学特征通过高效液相色谱-串联质谱（HPLC-MS/MS）表征，能够注释关键的酚类和黄酮类化合物。特定的橙色姜黄和薄荷配方分别使微藻细胞增殖相较于对照提高最多31.88%和28.95%。然而，尽管生物量更高，总类胡萝卜素含量并未相应增加；橙色姜黄提取物甚至导致类胡萝卜素含量降低90.84%至92.86%。这些发现表明，外源性抗氧化剂可能抑制触发杜氏盐藻类胡萝卜素生物合成所需的氧化应激信号。此外，在较高温度下制备的葡萄皮提取物比在较低温度下获得的提取物更能促进藻类生长。这些发现强调了植物提取物在调节微藻生长和次生代谢中的双重作用，表明富含抗氧化剂的提取物可用于在后续诱导应激介导的类胡萝卜素生成之前增强生物量积累，从而可能提高生物技术产量。

杜氏盐藻（Dunaliella salina）是一种耐盐的绿色微藻，能在高盐环境中生存，并被认为是天然类胡萝卜素最丰富的来源之一。其β-胡萝卜素含量可占干重14%，其中约40%为生物活性9-顺式异构体。类胡萝卜素通常在高盐、强光、营养限制等胁迫条件下积累，这些条件导致活性氧（ROS）产生，进而激活微藻的抗氧化防御系统。植物源性提取物富含酚类、黄酮类等次生代谢产物，可作为外源抗氧化剂，可能通过调节氧化还原状态影响微藻生长和代谢。然而，目前关于复杂植物水提物对杜氏盐藻的影响研究不足，特别是同时评估其对细胞生长和类胡萝卜素含量的影响、提取温度的生物活性影响以及补充时机的作用。为填补这些空白，研究人员开展了本研究。研究人员选取姜黄（Curcuma longa）的黄色和橙色粉末、薄荷（Mentha sp.）、葡萄皮（Vitis sp.）和芒果皮（Mangifera indica）为材料，通过煎煮法制备水提物，采用两阶段培养策略。第一阶段在接种时添加0.5%提取物，第二阶段在指数生长期后期（第17天）于pH受控条件下添加。研究人员通过直接细胞计数监测生长，通过分光光度法测定总类胡萝卜素含量，利用HPLC-MS/MS表征化学组成，并采用DPPH法评估抗氧化活性。研究发现，植物提取物的作用高度依赖于植物材料、提取温度和添加时机。橙色姜黄提取物在第二阶段使细胞浓度达到最高，但显著降低了类胡萝卜素含量；葡萄皮提取物在较高温度下获得更好生长，同时保持接近对照的类胡萝卜素水平；薄荷提取物呈现先抑制后恢复的双相响应。这些发现表明，富含抗氧化剂的植物提取物可通过外源抗氧化作用抑制胁迫信号，从而促进生物量积累，但可能不利于类胡萝卜素诱导。该研究为利用植物提取物作为生物基调节剂、结合顺序培养策略提升微藻生物技术产量提供了新思路，并支持农业工业副产物的循环利用。论文发表在《Fermentation》。

主要技术方法包括：从苏格兰藻类和原生动物保藏中心获得杜氏盐藻CCAP 19/18品系；植物材料来自巴西圣保罗州；提取物通过煎煮（56–60°C 10分钟；70–80°C 20分钟）制备；两阶段培养实验（第一阶段无pH控制，第二阶段控制pH 7.0±0.5）；细胞计数使用Neubauer血球计数板；总类胡萝卜素含量使用乙醇-己烷提取后A₄₅₀×25.2经验公式；代谢物表征采用HPLC-MS/MS并结合GNPS分子网络；抗氧化活性使用DPPH自由基抑制率测试；统计分析采用单因素方差分析和Tukey检验。

3.1 干植物材料的近似组成
通过常规化学分析测定五种植物材料的脂质、蛋白质、灰分和碳水化合物含量，发现不同材料间差异显著。例如，葡萄皮脂质含量最高（24.36%），薄荷蛋白质含量最高（29.41%），芒果皮碳水化合物含量最高（82.89%）。该分析为后续水提物中可溶性成分的潜在作用提供了基线参考。

3.2 植物水提物的植物化学特征与抗氧化活性
定性植物化学筛选和HPLC-MS/MS分析显示，水提物中含有酚酸、黄酮、姜黄素、花青素、单宁等化合物，其组成因植物种类和提取温度而异。例如，薄荷水提物中检测到木犀草素衍生物和迷迭香酸；葡萄皮水提物中检测到槲皮素3-O-葡萄糖醛酸苷；高温提取有助于释放结合态化合物。

3.3 DPPH自由基清除活性
DPPH测定显示，橙色姜黄（56–60°C）提取物的抑制率最高（99.20%），芒果皮（70–80°C）为98.14%，薄荷提取物最低（约66–67%）。葡萄皮提取物在两个温度条件下均保持约87%的抑制率，表明其抗氧化活性相对稳定。

3.4 使用0.5%植物提取物培养杜氏盐藻
第一实验阶段（无pH控制）中，黄色姜黄（56–60°C）提取物在培养20天后获得最高细胞浓度（97.79×10⁴ cells·mL^?1），但培养后期pH升至10.32，可能构成混杂因素；橙色姜黄及部分提取物完全抑制生长。第二实验阶段在pH控制（7.0±0.5）下，第17天添加提取物后，橙色姜黄（56–60°C）在第26天达到最大细胞浓度474.00×10⁴ cells·mL^?1，显著高于对照（329.33×10⁴ cells·mL^?1）；葡萄皮和薄荷提取物也提高了最大细胞浓度；所有提取物添加后均出现短暂细胞浓度下降，随后恢复。

3.5 提取物处理后杜氏盐藻培养物中的总类胡萝卜素含量
分光光度法测定显示，对照组总类胡萝卜素含量最高（43.99 μg·mL^?1），葡萄皮（56–60°C）处理组为43.59 μg·mL^?1，与对照无显著差异；橙色姜黄处理组最低（3.14–4.03 μg·mL^?1）。总类胡萝卜素含量与生物量积累模式不一致，表明高生长并未伴随类胡萝卜素增加。

讨论部分指出，外源性抗氧化剂可能通过清除活性氧（ROS）抑制类胡萝卜素生物合成所需的氧化应激信号，这解释了橙色姜黄提取物降低类胡萝卜素含量的现象。提取物中多种酚类化合物可能通过协同作用调节微藻生理，但具体机制尚需进一步验证。根据生物量与类胡萝卜素积累的差异，未来可探索先促进生物量、再诱导类胡萝卜素生成的顺序培养策略。

结论部分翻译：本研究表明，来自姜黄、薄荷、葡萄皮和芒果皮的水提物可调节杜氏盐藻的生长和总类胡萝卜素含量，具体响应取决于植物材料、提取温度和补充时间。代谢谱显示提取物含有不同类别生物活性化合物，包括酚酸、黄酮、姜黄素、花青素和单宁。当在培养开始时添加，黄色姜黄（56–60°C）获得最高细胞浓度；当在指数生长期添加，橙色姜黄获得最高最大细胞生产力，但类胡萝卜素含量显著降低。葡萄皮提取物在特定提取条件下维持持续生长，同时总类胡萝卜素与对照统计学相当。整体上，52天培养表明补充富含抗氧化剂的植物提取物可产生不同的时间依赖性响应。但本研究未直接评估氧化应激调节和氧化还原信号机制，因此不能将差异归因于特定通路。生物量积累和总类胡萝卜素含量的对比响应支持未来研究顺序培养策略，即在初始生物量生产阶段使用植物提取物，随后移除并结合受控胁迫促进类胡萝卜素积累。这些策略需实验验证，但为利用植物源材料（包括农业工业残渣）作为微藻生物技术生物活性化合物来源提供了有用框架。