《Journal of Imaging》：Reproducible Semi-Automated Quantification of Vascularization in Bone Sections Using CD31 Immunohistochemistry and Trainable Weka Segmentation
编辑推荐：
血管化的定量评估在骨再生研究中具有重要意义，但CD31免疫组织化学染色的骨切片常通过手动或半定量方式评估，限制了可复现性与可比性。本研究旨在建立并验证一种可复现、开源的半自动化工作流，利用Fiji/ImageJ与Trainable Weka Segmentat
血管化的定量评估在骨再生研究中具有重要意义，但CD31免疫组织化学染色的骨切片常通过手动或半定量方式评估，限制了可复现性与可比性。本研究旨在建立并验证一种可复现、开源的半自动化工作流，利用Fiji/ImageJ与Trainable Weka Segmentation（TWS）定量骨切片中CD31阳性面积分数。研究人员分析了来自缺损/再生组织、股骨、胫骨及脊柱的大鼠CD31免疫组化骨切片。该工作流整合了标准化图像采集、预定义感兴趣区域（ROI）、基于像素的TWS分类、CD31阳性类别提取，以及CD31阳性面积与组织面积归一化（CD31.Ar/T.Ar）。两名独立观察者进行多次手动参考测量。手动CD31.Ar/T.Ar测量显示良好重测信度，观察者1与观察者2的平均变异系数（CV）分别为7.17%与6.84%，且观察者间一致性良好。独立训练的TWS分类器产生高度稳定的CD31.Ar/T.Ar值，总体平均CV为1.98%。手动评估每切片耗时3分17秒±1分35秒，而TWS工作流将初始分类器训练步骤与后续大批量图像的快速重复分析分离。本研究提供了一种透明、可复现且省时的开源工作流，用于骨切片CD31阳性血管面积分数的半自动化定量，并支持其作为临床前骨再生研究中血管组织形态计量学的可扩展方法。
研究背景方面，骨再生依赖成骨细胞与矿化基质形成，同时需要充足血管化供应氧、营养与信号分子，CD31（血小板内皮细胞黏附分子-1，PECAM-1）阳性血管与成骨微环境密切相关。目前骨血管化定量多依赖手动或半定量评估CD31免疫组化切片，受染色异质性、小血管断面、背景信号及观察者主观性影响，可复现性差。虽已有商业软件与部分开源工具用于骨组织形态计量，但针对CD31阳性血管面积的开源标准化流程仍缺失。为此，研究人员在《Journal of Imaging》发表该研究，建立并验证基于Fiji/ImageJ与Trainable Weka Segmentation（TWS）的半自动化、开源、可复现定量工作流，以CD31.Ar/T.Ar为核心终点，解决手动评估耗时与变异性高的问题。
关键技术方法上，研究人员使用已获批大鼠骨实验遗留的石蜡包埋切片（涵盖缺损/再生组织、股骨、胫骨、脊柱），经CD31单染（碱性磷酸酶-Vector Red显色、苏木精复染）后，在Zeiss Axio Imager M2系统以10×/20×为主采集校准图像；在Fiji/ImageJ中预定义ROI，利用TWS由三名研究者独立训练分类器区分CD31阳性信号、复染背景、空背景与伪影，输出分类图后提取CD31类别阈值化得二值掩膜，经Analyze Particles算面积，最终得CD31.Ar/T.Ar(%)；以两名观察者重复手动勾画为参考，评估重测信度、观察者间一致性、分类器间变异及与手动法偏倚，并记录耗时。
研究结果部分，3.1节建立半自动化TWS工作流显示该流程可跨缺损/再生、股骨、胫骨、脊柱切片稳定提取CD31阳性区。3.2节手动参考测量中，观察者内平均CV为7.17%（观察者1）与6.84%（观察者2），Pearson r=0.906、ICC=0.869，证明手动法可作参考但变异性更高。3.3节三个独立训练TWS分类器各重复运行，同分类器结果完全一致，三分类器均值6.06%、6.02%、6.07%，总体均值6.05%、平均CV 1.98%，证实技术确定性与分类器间高稳定性。3.4节手动与TWS对比显示Pearson r=0.93，TWS均值低1.24个百分点（p<0.01），偏差源于边界勾画宽窄与弱染小血管归类差异，非绝对真值偏移。3.5节耗时上手动均3分17秒±1分35秒（缺损区最长5分12秒），TWS单次训练15–20分钟，后续每图约2分钟（64 GB RAM工作站），大批量可无人值守处理。
讨论部分指出，TWS像素级分类在空间精度与抗疲劳上优于手动，1.98%分类器间CV低于文献报道的手动骨形态计量变异；CD31选作内皮标记可覆盖成熟与未成熟血管，工作流概念可迁移至CD105、endomucin等标记但需重训。局限性包括分类器初训依赖使用者标注习惯、非特异显色与折叠伪影可致误分，故建议跨实验室共享训练集与预处理排伪影。结论部分原文表明：基于TWS的半自动化组织形态计量分析实施简便、可复现且较手动评估大幅提速；凭借开源、高复现性与可扩展性，该工作流是临床前骨愈合及相关成像研究中血管生成定量的有力工具。
