《iScience》：IRX1 suppresses cervical squamous cell carcinoma progression by downregulating ACLY expression to inhibit lipid synthesis
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IRX1在宫颈癌中发挥肿瘤抑制因子的功能，但其潜在机制尚不清楚。在本研究中，研究人员观察到IRX1表达因启动子高甲基化而在宫颈癌细胞中频繁下调。功能上，IRX1过表达抑制了细胞增殖、迁移和侵袭，而IRX1敲低则增强了这些恶性表型。机制上，IRX1直接结合ATP
IRX1在宫颈癌中发挥肿瘤抑制因子的功能，但其潜在机制尚不清楚。在本研究中，研究人员观察到IRX1表达因启动子高甲基化而在宫颈癌细胞中频繁下调。功能上，IRX1过表达抑制了细胞增殖、迁移和侵袭，而IRX1敲低则增强了这些恶性表型。机制上，IRX1直接结合ATP柠檬酸裂解酶（ACLY）启动子并招募NME3，从而形成转录抑制复合物。该IRX1-NME3/ACLY轴抑制了从头脂肪酸合成，表现为乙酰辅酶A、丙二酰辅酶A、甘油三酯、胆固醇和脂滴水平降低。一致地，ACLY过表达部分逆转了IRX1对脂质代谢和肿瘤进展的抑制效应。总之，研究结果揭示IRX1通过转录抑制ACLY介导的脂质生成而发挥代谢性肿瘤抑制因子的作用。
宫颈癌是主要由高危型人乳头瘤病毒（HPV）持续感染引起的宫颈恶性肿瘤，早期常无症状，筛查对二级预防至关重要。IRX1是Iroquois家族成员，编码胚胎发育关键的转录因子，既往研究已表明其在胃癌、非小细胞肺癌（NSCLC）和头颈鳞状细胞癌（HNSCC）中因启动子高甲基化而下调，发挥肿瘤抑制功能，但其在宫颈鳞状细胞癌（CESC）中的调控机制和治疗潜力尚未完全阐明。脂质代谢重编程是癌症的重要标志，为膜生物合成、能量储存和信号分子合成提供原料，转录因子通过调控关键脂质生成酶的表达协调这一代谢适应。因此，鉴定脂质代谢的上游调控因子对理解肿瘤进展和开发靶向治疗策略至关重要。研究人员开展本研究旨在阐明IRX1在CESC中的功能及分子机制。
研究人员通过体外细胞实验、数据库分析和体内异种移植模型，发现IRX1在宫颈癌细胞中因启动子高甲基化而频繁下调，功能上抑制细胞增殖、迁移和侵袭。机制上，IRX1直接结合ATP柠檬酸裂解酶（ACLY）启动子并招募核苷二磷酸激酶3（NME3），形成转录抑制复合物，从而抑制从头脂肪酸合成，阻碍宫颈癌进展。该研究定义了IRX1-NME3/ACLY轴作为CESC代谢重编程的关键调控节点，揭示了转录调控与代谢重编程联系的新机制，论文发表在《iScience》。
为开展研究，研究人员主要使用了以下关键技术方法：利用宫颈癌细胞系HeLa、C33A、SiHa、CaSki及非致瘤性宫颈上皮细胞系End1/E6E7；采用RNA-seq和基因集富集分析（GSEA）鉴定差异表达基因及富集通路；运用染色质免疫沉淀（ChIP）和双荧光素酶报告基因验证IRX1与ACLY启动子的直接结合；通过免疫共沉淀联合质谱（Co-IP/MS）鉴定IRX1互作蛋白NME3；采用亚硫酸盐测序PCR（BSP）检测启动子甲基化状态；利用TCGA/UALCAN数据库分析临床样本中IRX1和ACLY的表达及甲基化；在NOD-SCID γ（NSG）小鼠中建立皮下异种移植模型进行体内功能验证。
研究结果部分如下：
IRX1抑制CESC细胞的迁移和增殖：Western blot显示IRX1蛋白在宫颈癌细胞系中低于非致瘤性宫颈上皮细胞系End1/E6E7。CCK-8、EdU和集落形成实验表明IRX1过表达降低细胞增殖率、EdU阳性细胞比例和集落形成能力，而IRX1敲低则增强这些能力。Transwell和伤口愈合实验显示IRX1过表达抑制细胞迁移，敲低则促进迁移，表明IRX1在CESC中发挥肿瘤抑制功能。
启动子DNA甲基化表观调控IRX1表达：UALCAN数据库分析显示宫颈癌组织中IRX1启动子甲基化水平（β值）高于正常组织。DNA甲基转移酶抑制剂5-氮杂-2′-脱氧胞苷（AZA）处理剂量依赖性地恢复HeLa和SiHa细胞中IRX1表达。BSP证实宫颈癌细胞系和临床组织中IRX1启动子CpG岛甲基化密度高于正常对照。此外，IRX1过表达增加E-钙黏蛋白、降低N-钙黏蛋白和波形蛋白水平，与抑制迁移和侵袭的功能一致。
IRX1抑制宫颈癌细胞的脂质代谢：RNA-seq和GSEA显示IRX1过表达后差异表达基因显著富集于脂质代谢和胆固醇代谢通路。Western blot显示IRX1过表达降低ACSL3、SREBP1、FASN和ACLY蛋白水平，敲低则升高。油红O染色显示IRX1过表达减少脂滴丰度，敲低增加脂滴。甘油三酯和胆固醇水平在IRX1过表达时降低，敲低时升高，证实IRX1抑制脂质合成。
IRX1通过转录抑制ACLY基因表达调控脂质合成：通过RNA-seq数据与GSEA、GeneCards数据库交叉分析，鉴定出7个重叠基因，ACLY因位于脂肪酸和胆固醇合成代谢分支点且差异表达最大而被选为关键靶点。HumanTF数据库预测ACLY启动子区存在3个IRX1结合位点，ChIP证实IRX1特异性结合位点1（-1328至-1321）。双荧光素酶报告基因实验表明IRX1抑制含位点1的启动子转录活性，突变该位点后抑制作用消失。IRX1过表达显著降低乙酰辅酶A和丙二酰辅酶A水平，敲低则升高。
IRX1促进NME3核转位共同调控ACLY表达：Co-IP/MS鉴定NME3为高置信度IRX1互作蛋白。免疫荧光显示IRX1与NME3在核内显著共定位，内源性和外源性Co-IP验证了二者的物理相互作用。IRX1不改变NME3的mRNA和蛋白表达水平。双荧光素酶实验显示NME3单独过表达不影响ACLY启动子活性，但与IRX1共表达时增强IRX1介导的转录抑制。核质分离和免疫荧光实验表明IRX1过表达促进NME3核积累，敲低则减少核定位，提示IRX1通过招募NME3组装转录调控复合物。
IRX1-NME3/ACLY轴介导脂肪酸合成：回补实验表明，在IRX1过表达细胞中再表达ACLY，逆转了IRX1引起的甘油三酯、胆固醇、脂滴、乙酰辅酶A和丙二酰辅酶A水平降低；在IRX1敲低细胞中敲低ACLY，则逆转了这些代谢物的升高，证实IRX1/NME3复合物通过调控ACLY影响脂质代谢。
IRX1-NME3/ACLY轴在体外抑制CESC增殖和迁移：UALCAN数据库显示ACLY在CESC组织中表达上调，KM plotter生存分析显示ACLY高表达与患者较差的总生存相关。功能实验表明，ACLY过表达部分逆转IRX1过表达对细胞增殖和迁移的抑制，ACLY敲低则部分逆转IRX1敲低对增殖和迁移的促进。
体内实验：将对照、IRX1过表达及IRX1/ACLY共过表达的HeLa细胞皮下注射NSG小鼠，IRX1过表达显著抑制肿瘤生长，而ACLY共过表达部分恢复肿瘤生长。免疫组化染色显示IRX1过表达肿瘤中ACLY表达下调、增殖标志物Ki-67降低、凋亡标志物BAX升高，而ACLY共过表达逆转了这些变化，进一步验证了IRX1通过ACLY发挥肿瘤抑制作用。
讨论部分指出，脂质代谢重编程是癌症的重要特征，转录因子在协调代谢适应中发挥核心作用。该研究证实IRX1通过招募NME3形成转录复合物抑制ACLY表达，从而抑制从头脂肪酸合成，这一机制在HPV阳性和阴性细胞中均发挥作用，表明该轴独立于HPV状态。ACLY是催化柠檬酸转化为乙酰辅酶A的关键代谢酶，其表达和活性在多种恶性肿瘤中上调，是连接碳水化合物代谢与脂质生物合成的关键节点，具有重要的治疗靶点价值。研究局限性包括：功能实验主要基于体外过表达和敲低系统，异种移植模型样本量较小（每组n=5），缺乏独立临床队列验证，未进行整体代谢组学分析，且NME3协助IRX1介导转录抑制的精确分子机制有待深入研究。
研究结论：IRX1是宫颈癌中的肿瘤抑制因子，其表达被启动子CpG岛甲基化表观沉默。机制上，NME3被IRX1招募形成转录复合物共抑制ACLY表达，进而抑制从头脂肪酸合成，阻碍宫颈癌进展。IRX1-NME3/ACLY轴是宫颈癌的关键调控节点，为代谢靶向治疗提供了潜在靶点。
