一种用于体内分子成像监测镍合金植入物镍离子释放的顺序激活 DNA 生物传感器

《Analytica Chimica Acta》：A Sequentially Activated DNA Biosensor for In Vivo Molecular Imaging of Nickel Ion Release from Nickel Alloy Implants

　　

摘要

背景

现有的镍离子 (Ni²⁺) 荧光探针不足以用于 体内监测 Ni²⁺ 释放动力学及临床用镍合金植入物的深层组织追踪。因此，本研究开发了一种顺序激活的 DNA 纳米机器 (18S-Zyme-tFNA)，用于胞质 Ni²⁺ 的 体内成像。

结果

18S-Zyme-tFNA 利用 Ni²⁺ 依赖性 DNA 酶作为其核心识别模块。其催化结构域预先与互补于 18S rRNA 的锁链杂交，从而在胞质进入前保持 DNA 酶处于非活性状态。细胞内化后，丰富的内源性 18S rRNA 通过序列特异性杂交竞争性置换锁链，恢复 DNA 酶的催化构象。在 Ni²⁺ 存在下，激活的 DNA 酶特异性切割底物链内的核糖腺苷 (rA) 残基，诱导荧光团和淬灭剂的空间分离，从而激发荧光信号。关键在于，每个酶分子催化多个底物切割事件，从而通过酶周转机制实现强大的信号放大。实验结果表明，18S-Zyme-tFNA 实现了低检测限 (LOD = 0.09 μM)，并表现出对 Ni²⁺ 优于其他金属离子的选择性。特别是，18S-Zyme-tFNA 实现了足部、皮下和骨内镍合金植入物中 Ni²⁺ 的 体内可视化，且未观察到显著的器官毒性。

意义

本研究开发了一种顺序激活的 DNA 酶 -tFNA 生物传感器，能够在生命系统中选择性和放大成像胞质 Ni²⁺。通过整合 18S rRNA 介导的细胞内激活与 Ni²⁺ 依赖性催化信号产生，该平台提高了基于 DNA 的金属离子传感的特异性和生物适用性。重要的是，它将 Ni²⁺ 成像从细胞扩展到哺乳动物镍合金植入物模型，为评估植入物相关的镍释放和生物安全性提供了有用的工具。

引言

镍离子 (Ni²⁺) 是生物体内必需的微量元素，可能参与铁代谢 [1]、骨代谢 [2]、生长发育以及某些酶促过程 [3]；因此，维持体内的镍稳态具有潜在的生理意义。然而，过量 Ni²⁺ 暴露诱导的毒性作用定义更明确且机制更被理解：高水平镍暴露不仅会触发氧化应激、线粒体功能障碍、炎症反应、免疫失调和 DNA 损伤，临床和流行病学证据还表明其与皮肤过敏、肺损伤、肾和心血管损伤以及各种肿瘤风险增加密切相关 [4]，[5]，[6]。此外，Ni²⁺ 不足可能影响生长发育 [7]、造血 [1] 和矿物质代谢 [8]。因此，开发一种在 体外和 体内 环境下均具有高灵敏度和高选择性的精确 Ni²⁺ 监测平台具有重要意义。这样的平台将推进 Ni²⁺ 在细胞稳态、氧化应激和疾病发病机制中的动态研究，同时也能实现环境暴露评估和早期诊断。

测定 Ni²⁺ 浓度的典型方法包括火焰原子吸收光谱法 [9]、原子吸收光谱法 [10]、火焰光度法 [11] 和电感耦合等离子体质谱法 [12]。虽然上述方法具有高灵敏度和定量准确性，但它们通常存在仪器昂贵、操作复杂、样品前处理繁琐以及难以实现 体内监测等局限性。少数研究采用小分子荧光探针实现了活细胞和斑马鱼胚胎中 Ni²⁺ 的 原位成像，从而验证了生物系统中镍检测的技术可行性。以前的 Ni²⁺ 成像研究主要依赖小分子荧光探针，并主要集中在水样、培养细胞或斑马鱼胚胎上 [13]，[14]，证明了生物系统中 Ni²⁺ 可视化的可行性。然而，这些模型与哺乳动物植入场景仍有显著差异，无法满足监测植入物相关 Ni²⁺ 释放和评估生物安全性的需求。因此，迫切需要开发一种在复杂生物环境中 体内 原位监测植入物相关 Ni²⁺ 释放的策略。

分子成像是一项强大的技术，它利用靶向特异性探针可视化和动态追踪生物体内的生物分子，从而实现对分子靶标的实时、非侵入性监测 [15]，[16]，[17]。DNA 纳米探针凭借其强大的可编程性、高识别特异性和易于功能化的特点，已成为分子成像的重要使能工具，为细胞和动物模型中痕量分子的 原位检测提供了新策略 [18]，[19]，[20]，[21]。金属依赖性 DNA 酶因其催化活性可被特定的金属辅因子选择性调节，从而实现可编程且高选择性的信号产生，已成为金属离子传感中极具吸引力的识别元件 [22]，[23]。基于这一特性，我们采用 Ni²⁺ 依赖性 DNA 酶作为核心识别模块，合理设计了一种基于 DNA 的纳米探针，用于实时、空间分辨的胞质 Ni²⁺ 原位监测。为了实现胞质 Ni²⁺ 的精确检测，该探针整合了互补于 18S rRNA 的锁链。锁链最初隔离 Ni²⁺ 依赖性 DNA 酶，并在细胞进入前抑制其催化活性。18S rRNA 在胞质中具有高丰度，可提供足够的内源性探针激活触发器 [24]。此外，其胞质分布使其能够作为内源性空间门控信号，使 Ni²⁺ 依赖性 DNA 酶在探针进入目标胞质区室后解锁 [25]。如图 1A 所示，18S-Zyme-tFNA 通过自组装构建。简而言之，将 S1、S2、S3 和 S4 按等摩尔比混合，并从 95 °C 到 25 °C 进行受控温度梯度退火，形成四面体框架 (tFNA)。随后，将 S5 (DNA 酶) 和 S6 (锁序列) 也按等摩尔比混合，并在相同的温度梯度下退火，形成 L-Zyme。最后，将 tFNA、L-Zyme 和 HP 按 1:1:3 摩尔比混合，并在 37 °C 下孵育 30 min，自组装成 18S-Zyme-tFNA。进入细胞后，内源性 18S rRNA 通过互补碱基配对结合锁序列，从而恢复 DNA 酶的催化活性。随后，在 Ni²⁺ 存在下，激活的 DNA 酶特异性切割底物链上的核糖腺苷 (rA) 位点，诱导荧光团和淬灭剂的空间分离，从而产生荧光信号。同时，DNA 酶催化其底物的迭代切割，实现酶信号放大。荧光强度与细胞内 Ni²⁺ 浓度呈正相关；Ni²⁺ 水平越高，荧光信号越强 (图 1B)。本研究的创新点总结如下：首先，在 18S-Zyme-tFNA 中，互补于 18S rRNA 的锁序列阻断 DNA 酶的催化核心，实现了对胞质 Ni²⁺ 的精确检测。其次，18S-Zyme-tFNA 实现了对痕量 Ni²⁺ 的高灵敏度定量，并将适用场景从 体外和细胞设置扩展到 体内成像，从而显著提高了时空分辨率及生理相关性。第三，18S-Zyme-tFNA 实现了足部、皮下和骨内镍合金植入物中 Ni²⁺ 的 体内可视化，且未观察到显著的器官毒性。总之，该平台有望在复杂生物环境中实现对 Ni²⁺ 的原位、精确和动态监测，从而为阐明 Ni²⁺ 毒理学机制和促进下一代生物医学应用的发展提供强大的技术平台。

章节片段

18S-Zyme-tFNA 的设计、合成与表征

将 18S-Zyme-tFNA 工程化为三维 DNA 纳米结构是实现胞质 Ni²⁺ 选择性且高效 原位检测的关键使能因素 [26]。18S-Zyme-tFNA (图 1A) 的组装涉及：(i) 将四种等摩尔的单链 (S1 - S4) 从 95 °C 退火至 25 °C 以形成 tFNA；(ii) 类似地将等摩尔的 DNA 酶和锁链退火以产生 L-Zyme；以及 (iii) 将 tFNA、L-Zyme 和 HP 按 1:1:3 摩尔比混合，并在 37 °C 下孵育 30 min 以

结论

总之，成功开发了一种具有内在 DNA 酶介导信号放大的顺序激活 DNA 纳米机器，用于胞质 Ni²⁺ 的 体内成像。核心设计理念是利用内源性 18S rRNA 作为解锁信号，特异性恢复 Ni²⁺ 依赖性 DNA 酶的催化活性，并通过底物链的循环切割实现信号放大。18S-Zyme-tFNA 的信号输出主要受 Ni²⁺ 依赖性 DNA 酶调控

材料

HPLC 纯化的 DNA 和 RNA 寡核苷酸 (详见表 S1)，以及包括氯化镍、氯化锌和氯化铬在内的无机盐，均购自上海生工生物技术有限公司。用于评估细胞增殖和细胞毒性的 CCK-8 检测试剂盒由南京诺唯赞生物科技股份有限公司提供。用于本研究的 8 周龄雄性 KM 小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司 (中国北京)。

CRediT 作者贡献声明

Wancun Zhang: 写作 – 回顾 & 编辑，监督，概念化。 Caiyu Zhang: 写作 – 原稿，数据整理。 Fei Zhang: 写作 – 原稿，数据整理。 Jingzhe Zang: 数据整理。 Xianwei Zhang: 写作 – 原稿，数据整理。 Ying Liang: 数据整理。 Mengxin Zhang: 数据整理。 Zhe Wang: 数据整理。 Kangbo Liu: 数据整理。 Yingyu Zhang: 写作 – 回顾 & 编辑，监督，概念化

利益冲突声明

作者声明他们没有任何已知的竞争性财务利益或个人关系，可能会影响本报告中的工作。

致谢

本工作由 国家自然科学基金 (32201237)、河南省科技项目 (262102311041, 262102311123, 262102310053)、河南省医学科技计划 (SBGJ202403052, SBGJ202502095, LHGJ20250596, LHGJ20250605)、郑州市优秀青年科技人才 (博士) 培养项目 (2024046)、国家药品监督管理局 医疗器械质量评价重点实验室基金 (2024-02) 资助。

Fei Zhang|Caiyu Zhang|Xianwei Zhang|Jingzhe Zang|Mengxin Zhang|Ying Liang|Kangbo Liu|Zhe Wang|Yingyu Zhang|Wancun Zhang

河南省卫生健康委员会儿童肿瘤精准诊治重点实验室，河南省儿童遗传发育性疾病重点实验室，河南省儿童疾病防治国际联合实验室，郑州大学附属儿童医院，中国郑州，450018