利用N-取代的NBD衍生物实现对甲基乙二醛的选择性荧光激活检测

《Analytical Biochemistry》：Selective fluorescence turn-on detection of methylglyoxal using N-substituted NBD derivatives

　　

数据提供了以下信息：

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合成了新的NBD探针，并通过荧光光谱、带有荧光检测的高效液相色谱(HPLC)、液相色谱-质谱(LC–MS)和密度泛函理论(DFT)计算对其进行了表征。

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N取代的衍生物对MGO表现出更强和更稳定的选择性响应。

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NBD探针的检测下限更低，其检测限度大约是NBD-H的100到200倍。

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即使在存在其他羰基干扰物的情况下，也能在人血浆中进行直接定量。

引言

甲基乙二醛(MGO)是一种高度反应性的内源性α-二羰基化合物，主要通过糖酵解中间体甘油醛-3-磷酸和二羟基丙酮磷酸的非酶促降解产生[1],[2],[3]。在健康个体中，其在血浆中的浓度约为0.06–0.25 μM，在细胞中的浓度为1–5 μM[3]。由于其强亲电性，MGO容易修饰蛋白质和核酸中的亲核位点，并且是晚期糖基化终产物的主要前体。其异常积累（称为二羰基应激）还与氧化应激、活性氧和氮物种的形成、蛋白质羰基化以及不可逆的大分子损伤有关[1],[3],[4]。这些过程会导致细胞功能障碍，并与2型糖尿病、心血管疾病、代谢综合征及相关并发症以及其他与年龄相关的疾病（如神经退行性疾病）相关[1],[3],[4]。因此，可靠的MGO测量对于阐明其生物学作用和评估其作为代谢和氧化障碍标志物的价值非常重要。

MGO的定量分析要求较高，因为该化合物在溶液中的含量极低、具有高度反应性且易水解。标准方法通常使用o-苯二胺衍生化后进行HPLC或LC–MS/MS分析[6],[7],[8]。尽管这些方法灵敏度较高且能提供结构信息，但需要长时间的准备工作、色谱分离、内标物和专用设备。基于荧光的方法操作更简单、灵敏度更高，并且适用于微孔板和成像[9]。几种MGO探针使用1,2-二胺（o-苯二胺）作为识别单元，包括MBo[10]、NI-OPD[11]以及基于钌或铱的荧光系统[12]。然而，由于1,2-二胺会与其他α-二羰基化合物（如乙二醛）发生反应，这种交叉反应可能会在没有分离的情况下高估MGO的浓度；即使经过选择性优化的探针仍会检测到乙二醛的荧光信号[11]。此外，它们还可能与一氧化氮衍生物形成荧光三唑[10],[13]。醛与肼的缩合是一种成熟的羰基衍生化方法，生成的腙化合物具有较高的平衡稳定性。这种反应在微酸性条件下具有较高的反应效率，特别适合分析应用[14]。基于香豆素、BODIPY和硝基苯并呋喃的探针能与醛和酮生成腙[15],[16]。其中，4-肼基-7-硝基苯并呋喃（NBD-H）因其电子缺乏的荧光团而对局部电子环境的变化非常敏感[17]。然而，其广泛的羰基反应性限制了选择性，而腙的荧光强度和稳定性取决于羰基结构及反应条件，还可能受到腙可逆性和水解的影响[18],[19],[20]。虽然有多种荧光探针可以检测MGO，但大多数探针是专为成像应用设计的，而非用于在血浆等基质中进行无需分离的定量[21],[22]。要实现后者，需要控制而非消除肼的羰基反应性，以优先检测特定的二羰基化合物。基于我们之前将NBD-H作为蛋白质羰基检测荧光探针的研究[23]，我们最近发现对NBD-H中的氮进行N取代可以提高其荧光稳定性和分析可靠性，从而更好地检测人血浆中的蛋白质结合羰基[24]。甲基、乙基和苄基取代基减少了可溶性低分子量羰基的信号强度，同时保持了对氧化蛋白质的稳定响应。这些结果表明N取代是一种调节识别位点空间和电子特性的有效方法。在这里，我们将这一策略扩展到特定的低分子量目标，探讨更广泛的N取代NBD衍生物是否能够优先放大对MGO的响应，而抑制对相关醛类和α-二羰基化合物的响应。我们合成了含有线性、分支或苄基取代基的衍生物，并研究了取代基大小、拓扑结构和电子效应如何影响MGO的反应性、腙的形成、荧光增强和信号稳定性。探针-羰基加合物通过荧光光谱、带有荧光检测的高效液相色谱(HPLC-FLD)和液相色谱-质谱(LC–MS)进行分析。密度泛函理论(DFT)和时依赖密度泛函理论(TD-DFT)用于评估反应热力学和电子结构。最后，在含有生物相关羰基干扰物的人血浆中评估了探针的性能。目标是建立一种适用于微孔板的荧光测定方法，该方法只需简单的蛋白质沉淀步骤，无需色谱分离或复杂的样品处理。

章节摘录

化学品和仪器

所有化学品均从Sigma-Aldrich（法国Saint Quentin Fallavier）和TCI Europe N. V.（比利时Zwijndrecht）购买，无需进一步纯化即可使用。闪柱色谱使用Isolera One（Biotage，德国）设备，填料为Sf?r Silica cartridges（60 μm）。NMR谱在AV400光谱仪（Bruker）上记录，¹H NMR的频率为400 MHz，¹³C NMR的频率为100.6 MHz。化学位移(δ)以百万分之几(ppm)表示，相对参考物质DMSO-d₆。

探针合成

在本研究中，根据我们团队先前开发的路线[24]合成了四种新的N取代NBD探针（NBD-i-Pr 3a、NBD-n-Pr 3b、NBD-i-Bu 3c和NBD-n-Bu 3d），详见图1。化合物1a-d是通过叔丁基-2-(丙-2-亚基)肼羧酸的烷基化得到的。之后，在酸性条件下脱保护得到2a-d，产率良好。最后一步是引入NBD骨架。

结论

本研究表明，对4-肼基-7-硝基苯并呋喃骨架进行N取代是一种有效提高MGO荧光检测的方法。未经取代的NBD-H虽然表现出广泛的羰基反应性，但荧光信号不稳定，校准线性差，且在血浆中的灵敏度有限。大多数N取代的衍生物对MGO的响应更强、更持久、更具选择性。色谱分析证实了相应衍生物的形成。

CRediT作者贡献声明

Sylvia Pietri：撰写 – 审稿与编辑、监督、资源管理、项目协调、概念构思。pierre stocker：撰写 – 审稿与编辑、监督、方法学设计、实验研究、数据分析、概念构思。David Bergé-Lefranc：实验研究、数据分析。Miquel Huix-Rotllant：实验研究、数据分析。Camille Nguyen：撰写 – 审稿与编辑、资源管理、数据分析。Cédric Spitz：初步撰写、方法学设计、数据分析。

数据可用性

在本研究生成和分析的数据集可应要求向通讯作者索取。

伦理批准

人类血液样本来自établissement Fran?ais du Sang，授权号为ALC/PIL/DIR/AJR/FO/606。使用人类样本获得了相关监管机构的批准，并遵循赫尔辛基宣言进行实验。

作者声明没有利益冲突。

资助

法国高等教育部和研究部提供。本研究得到了法国国家研究署通过项目NEUTROX(ANR-21-CE15-0039)的支持。

利益冲突声明

? 作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的研究。

致谢

作者感谢Mathieu Cassien和Nicolas Vidal（SMBSO-ICR, CNRS UMR 7273）提供的宝贵帮助。

Adrien Moragues|Léo Jingeot|Camille Nguyen|Cédric Spitz|David Bergé-Lefranc|Miquel Huix-Rotllant|Sylvia Pietri|Pierre Stocker