《Analytical Biochemistry》：Simultaneous GC–MS Determination of Unsubstituted, Hydroxy-, Amino-, and Hydroxy-amino Short-Chain Fatty Acids Together with Amino Acids in Biological and Food Samples Following Derivatization
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•对取代和未取代的短链脂肪酸（SCFAs）以及氨基酸进行的同时GC-MS分析。•衍生化使得在单次分析过程中能够快速定量SCFAs和氨基酸。•该方法已用于生物和食品样品的分析验证。引言代谢组学已成为研究人类健康和疾病背后生化机制的强大工具，它可以提供关于内源性和微生物群衍生代谢物的
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对取代和未取代的短链脂肪酸（SCFAs）以及氨基酸进行的同时GC-MS分析。
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衍生化使得在单次分析过程中能够快速定量SCFAs和氨基酸。
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该方法已用于生物和食品样品的分析验证。
引言
代谢组学已成为研究人类健康和疾病背后生化机制的强大工具，它可以提供关于内源性和微生物群衍生代谢物的全面信息。其中，短链脂肪酸（SCFAs）和氨基酸因在宿主-微生物群代谢相互作用中起核心作用而被广泛关注，并逐渐被视为具有临床意义的生物标志物[1]、[2]。同时分析这些代谢物类别有助于深入了解肠道微生物活动、营养代谢和代谢稳态，因此准确测定它们的浓度成为代谢组学研究的重要目标[3]、[4]。
SCFAs是一类含有1到6个碳原子的脂族羧酸，主要通过结肠中不可消化的碳水化合物和蛋白质的厌氧细菌发酵产生[5]。除了作为微生物发酵的主要产物外，SCFAs还通过维持肠道屏障完整性和调节免疫反应发挥关键的代谢调节作用[6]、[7]、[8]。乙酸、丙酸和丁酸是主要的SCFAs，约占人体肠道总SCFA含量的90%，在结肠和粪便中的摩尔比例通常为60:20:20[9]。尽管含量较低，但由于其生物学重要性，羟基和氨基取代的SCFAs越来越受到关注[8]。羟基SCFAs具有抗氧化、抗炎和抗糖尿病特性[10]，而氨基SCFAs有助于微生物群与宿主之间的代谢通讯[11]。
某些氨基酸在中枢神经系统中充当神经递质或神经递质前体[12]，参与免疫功能[13]和肌肉代谢[14]，维持胃肠道稳态[15]，调节血糖[16]，并在特定生理条件下作为重要的能量底物[17]。因此，SCFAs和氨基酸浓度的变化与多种生理和病理状态密切相关。
已有多种生物流体和食品基质被用于这些代谢物的测定。唾液因其SCFAs和氨基酸谱型与口腔疾病、糖尿病及多种癌症相关而被认为是一种有前景的诊断液体[18]、[19]、[20]。尿液因易于采集和物理化学稳定性而被广泛使用，其浓度变化与肥胖、糖尿病和克罗恩病有关[21]、[22]、[23]。粪便样本提供了关于胃肠道和微生物状态的直接信息，因此在结直肠癌、代谢紊乱和肠易激综合症的研究中得到广泛应用[24]、[25]、[26]。除了生物医学意义外，SCFAs和氨基酸还是食品质量的重要指标，有助于 aroma 和风味的形成，并可作为食品加工过程中（尤其是在乳制品和鸡蛋中）掺假和生化变化的标志物[27]、[28]、[29]。
已采用多种分析技术来测定SCFAs和氨基酸，包括气相色谱（GC）[30]、[31]、高效液相色谱（HPLC）[32]、核磁共振（NMR）光谱[34]和毛细管电泳（CE）[20]。虽然LC–MS在分析极性代谢物方面具有优势且通常需要较少的衍生化处理，但在使用适当的衍生化策略时，GC–MS对于分析小有机酸和氨基酸仍然非常 attractive。由于SCFAs和氨基酸都呈极性且挥发性不足，因此通常需要化学衍生化。虽然硅基化或五氟苯基溴化物（PFBBr）衍生化技术具有高灵敏度，但往往受到严格的无水要求或繁琐样品制备程序的阻碍[35]、[36]。相比之下，烷基氯甲酸酯衍生化快速、简便，在温和的水性条件下高效进行，适用于高通量的临床和食品代谢组学研究[37]、[38]、[39]。使用单一的氯甲酸酯衍生化程序还可以在同一GC–MS工作流程中分析结构多样的含有羧基、羟基和氨基的代谢物。
本研究的主要目标是开发并验证一种单一切片-质谱（GC–MS）衍生化和色谱程序，用于同时测定未取代的SCFAs、羟基SCFAs、氨基SCFAs、羟基氨基SCFAs以及氨基酸。最初使用标准溶液优化了衍生化和液-液提取条件，以便独立于基质特异性效应评估该程序的内在分析性能。随后，将实际样品制备程序应用于唾液、尿液、粪便和冻干鸡蛋。这些针对特定基质的程序并非旨在穷尽所有可能的提取参数，其适用性通过精确度、基质效应和回收实验进行了评估。所提出的分析平台可以轻松扩展到包括其他SCFAs和氨基酸，从而扩大其在代谢组学、临床研究、微生物组研究和食品分析中的应用范围。
章节片段
试剂和化学品
甲酸购自Scharlau（西班牙）。乙酸、L-丙氨酸、甘氨酸、L-缬氨酸、L-苯丙氨酸和十五烷购自Fluka Chemie GmbH（瑞士）。丙酸、丁酸、异丁酸、戊酸、辛酸、DL-β-羟基丁酸钠盐、L-甲硫氨酸、L-赖氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-脯氨酸、(-)-天冬酰胺、天冬氨酸、L-谷氨酸、吡啶（Py）、氢氧化钠和二氯甲烷购自Sigma-Aldrich（美国）。
衍生化机制
烷基氯甲酸酯生成的衍生物具有稳定的色谱性能，特别适合极性化合物的GC–MS分析。由于烷基氯甲酸酯能选择性地与氨基、羧基和羟基反应，因此与其他衍生化方法相比具有多项优势，可生成更简洁的色谱图并提高分析性能[40]。在当前方法中，iBCF与合适的提取溶剂结合使用，最小化了色谱干扰
结论
本研究开发了一种简单、稳健且可靠的GC–MS方法，用于同时测定生物和食品样品中的未取代和取代的短链脂肪酸（SCFAs），包括羟基SCFAs、氨基SCFAs、羟基氨基SCFAs以及氨基酸。使用异丁基氯甲酸酯进行衍生化后，通过己烷进行液-液提取，在温和的反应条件下获得了高效的衍生化和满意的色谱性能。
CRediT作者贡献声明
Constantine Stalikas：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原稿，监督，数据管理，概念制定。Kalliroi-Maria Katsari：撰写 – 原稿，可视化，验证，方法学，形式分析
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