脂肪和油脂微生物分析中的样品前处理

《Applied Food Research》：Sample preparation for microbiological analysis of fats and oils

　　

脂肪和油脂因其疏水性而对微生物分析构成独特挑战，然而准确检测和计数这些基质中的微生物对于食品安全和质量至关重要。本研究评估并验证了多种可食用油脂（包括葵花籽油、橄榄油、可可脂、禽脂、牛脂和中链甘油三酯（MCT）油）微生物检验的样品前处理方案。研究人员比较了过滤、离心、直接涂布和使用乳化剂稀释等不同方法在病原体检测以及卫生指示菌和益生菌计数中的适用性。过滤和离心分别因滤膜堵塞和操作困难而被证明不实用，而直接涂布法无法适用于所有基质类型。研究人员确定使用预热缓冲蛋白胨水（BPW）补充1% w/w聚山梨酯80进行1：10稀释是适用于熔点低于50°C油脂的有效横向方案。该方案通过定性和定量方法在五种油脂中成功得到验证。对于高熔点脂肪，研究人员开发并验证了一种两步程序，即首先将样品用预热的油进行预稀释，然后再用含聚山梨酯80的预热BPW进行稀释。该程序扩展了当前ISO 6887系列标准中关于测试样品制备横向方法的内容，填补了高熔点脂肪方面的空白。

**脂肪和油脂微生物分析样品前处理研究解读**

**1. 研究背景**

油脂类基质通常不被认为含有高水平的微生物。然而，当微生物意外引入这类基质时，它们可以长时间存活，例如沙门氏菌在可可脂油中可存活21天，大肠杆菌在橄榄油中可存活30天，沙门氏菌在花生油中可存活96天。微生物可通过多种途径进入油脂，包括作为果实（如橄榄）正常微生物区系的一部分、通过灌溉水或有机肥料引入、加工过程中的设备污染、工人不当处理或存储容器不洁等。未精炼油脂未经热处理，可能含有相对较高的水分从而利于微生物存在；而完全精炼的植物油和脂肪通常经过高温处理，可降低水分含量并灭活大部分微生物污染。此外，油脂中的酚类化合物在储存期间也会影响微生物存活。另一方面，油脂在益生菌递送系统中具有应用价值：油基封装技术可增强益生菌在胃肠道中的存活率，通过形成物理屏障保护益生菌免受胆汁和胰酶的侵害。无论从食品安全角度还是从益生菌产品功效验证角度，对油脂基质中的微生物进行准确检测和计数均至关重要。

当前，可靠的样品前处理是所有分析方法的基础。ISO 6887系列标准为微生物检验的样品制备提供了指导，但对于高脂食品建议使用1：10稀释并添加聚山梨酯80进行乳化。然而，该标准系列并未明确涵盖纯油脂样品，也未涵盖熔点高于50°C的脂肪。文献中虽有多种样品前处理方案被描述，但缺乏系统的比较和验证以证明其适用性。因此，本研究旨在评估多种适用于纯油脂的样品前处理方案，并建立一套可同时应用于定性和定量微生物分析的横向样品前处理程序的验证数据。

**2. 主要技术方法**

研究人员选取了六种性质各异的油脂——葵花籽油、橄榄油、可可脂、禽脂、牛脂和中链甘油三酯（MCT）油，所有样品均通过商业X射线辐照灭菌（吸收剂量29-32 kGy，由瑞士D?niken的STERIS公司处理）。用于验证的微生物包括冻干的沙门氏菌（Salmonella）、大肠杆菌（E. coli）和喷雾干燥的乳酸双歧杆菌（Bifidobacterium lactis）培养粉末。样品前处理方案评估包括：过滤法、离心法、直接涂布法以及添加聚山梨酯80的稀释法。定性方法采用ISO 6579-1:2017检测沙门氏菌，定量方法采用ISO 4833-2:2013计数总活菌数（TVC）以及内部方法计数益生菌。验证研究遵循ISO 16140-2:2016原则，定性方法评估50%检出限（LOD₅₀），定量方法使用准确度剖面（accuracy profile）进行评估，以β-期望容忍区间（β-ETI）为判定依据，可接受限度为±0.5 log₁₀单位。

**3. 研究结果**

**3.1 过滤方案**

研究人员选用流动性相对较好的橄榄油进行过滤试验，使用0.22 μm滤膜。然而样品在过滤早期即堵塞滤膜，导致每个样品的处理时间超过30分钟。因此，过滤被判定为不适合作为样品前处理方案。

**3.2 离心方案**

研究人员对橄榄油、禽脂和可可脂进行了离心评估。结果发现，在仅保留细菌沉淀的同时去除上清液非常困难，且部分样品（如可可脂）在离心过程中发生凝固。因此，离心方案未被进一步采用。

**3.3 直接涂布**

直接涂布法使用金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）和大肠杆菌在禽脂和可可脂中进行评估，以及鼠伤寒沙门氏菌（S. Typhimurium）在橄榄油和葵花籽油中评估。结果显示，禽脂和可可脂的直接涂布回收存在低估现象。S. Typhimurium在橄榄油中未回收任何菌落，而在葵花籽油中可正常计数。橄榄油的抑制作用在含纯油样品的首个平板上尤为明显（无菌落可见），而后续稀释平板菌落过多无法计数。尽管直接涂布对高流动性油脂结果尚可，但无法适用于所有油脂类型，不符合横向方法的目标，因此未继续采用。

**3.4 BPW和聚山梨酯80稀释法**

**3.4.1 BPW和聚山梨酯80稀释**

聚山梨酯80（又称吐温80）是一种非离子型表面活性剂，常作为乳化剂使用。ISO 6887系列标准推荐在高脂食品中使用，对于含100%油脂的样品，推荐在稀释液中补充1%的聚山梨酯80。研究人员还发现预热稀释液有助于乳化。定性验证中，所有基质的LOD₅₀值均低于每测试份1.5 CFU，表明该方法具有较高的分析灵敏度。相比之下，ISO 6579-1:2017验证研究中新鲜奶酪凝乳（一种高脂食品基质）的LOD₅₀为每测试份5.7 CFU。定量验证中，总活菌计数（TVC）和益生菌计数的中位偏倚均接近零（TVC约为0至+0.06 log₁₀ CFU/g，益生菌约为0至0.15 log₁₀ CFU/g），所有结果均落在±0.5 log₁₀单位的可接受限度内，表明基质对微生物回收无显著影响。

**3.4.2 葵花籽油、BPW和聚山梨酯80稀释**

为处理高熔点脂肪（如牛脂），研究人员开发了两步稀释程序：先将样品在37°C下预软化，与预热至46°C的低熔点液态油（葵花籽油）按1：4比例混合并均质，再用含聚山梨酯80的预热BPW进行进一步稀释。定量测试中，10 g牛脂、40 mL葵花籽油、150 mL BPW和1%聚山梨酯80的组合满足乳酸双歧杆菌的可接受限度；牛脂对TVC和益生菌计数的中位偏倚分别约为0.05和0.15 log₁₀ CFU/g，偏倚分布重叠表明该前处理程序对两类微生物群体表现相当。定性检测中，25 g牛脂、100 mL葵花籽油、375 mL BPW和2%聚山梨酯80的方案获得LOD₅₀为每测试份0.6 CFU，表明分析单元中单个沙门氏菌细胞即有超过50%的检出概率。

**4. 讨论与结论总结**

研究讨论指出，过滤法和离心法因技术操作困难不适用于油脂样品前处理；直接涂布法仅对低粘度油脂有一定适用性，但无法作为横向方案。最终确定的稀释方案包括：针对熔点低于50°C的油脂，采用预热BPW含1%聚山梨酯80的1：10稀释；针对高熔点脂肪，先用预热油预稀释再用含聚山梨酯80的预热BPW二次稀释。该研究填补了ISO 6887系列标准在高熔点脂肪样品制备方面的空白。

研究结论表明：使用含1%聚山梨酯80的预热BPW进行1：10稀释可有效用于熔点低于50°C的纯油脂和脂肪基质的定性和定量分析；定性方法在所有评估的食品项目中均确认了可接受的灵敏度（LOD₅₀），定量结果在卫生指示菌（大肠杆菌）和益生菌（乳酸双歧杆菌）方面均保持在可接受范围内。高熔点脂肪需要先用预热油稀释再用含聚山梨酯80的预热BPW进行二次稀释，该方案也已通过定性和定量方法的验证。基于此验证研究，研究人员证明所述方案可可靠地用于脂肪和油脂基质的微生物分析，为食品安全、益生菌计数的合规性以及研究和工业环境中的质量评估提供了更可靠的支持。