《Horticulturae》：Genome-Wide Identification and Characterization of the F-Box Gene Family in Cucumber Under Heat Stress
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F-box蛋白通常作为SCF（SKP1-CUL1-F-box）E3泛素连接酶复合物的底物识别亚基，在介导选择性蛋白质降解和调控多种生物学过程中发挥关键作用。黄瓜（Cucumis sativus）是全球重要的蔬菜作物，但对热胁迫高度敏感，这严重限制了其产量和品质
F-box蛋白通常作为SCF（SKP1-CUL1-F-box）E3泛素连接酶复合物的底物识别亚基，在介导选择性蛋白质降解和调控多种生物学过程中发挥关键作用。黄瓜（Cucumis sativus）是全球重要的蔬菜作物，但对热胁迫高度敏感，这严重限制了其产量和品质。然而，CsFBX基因家族的系统表征及其在耐热性中的功能仍不清楚。研究人员利用高质量的CLv4.0参考基因组，鉴定出175个CsFBX基因，并基于系统发育分析将其分为六个分支。染色体定位和共线性分析表明，串联重复是CsFBX家族扩张的主要驱动力。启动子顺式元件分析显示，CsFBX启动子区域中富集了应激响应元件，表明其可能参与非生物胁迫响应。热胁迫下的转录组分析确定了三个显著诱导的候选基因：CsFBX25、CsFBX77和CsFBX87。在黄瓜中瞬时过表达CsFBX25和CsFBX77可减少高温下的黄化并降低电解质渗漏。综上所述，本研究系统表征了CsFBX基因家族，并确定了可能参与热胁迫响应的候选基因，为未来的功能研究奠定了基础。
全球变暖导致极端高温事件频发，热胁迫已成为制约农作物生产的重要非生物胁迫因素。泛素/26S蛋白酶体系统（Ubiquitin/26S Proteasome System，UPS）是真核生物中关键的翻译后调控系统，其中F-box蛋白作为SCF（SKP1-CUL1-F-box）E3泛素连接酶的底物识别亚基，通过选择性降解底物蛋白调控植物生长、发育和胁迫响应。尽管已在拟南芥、水稻等物种中开展了F-box基因家族的全基因组鉴定，但黄瓜（Cucumis sativus）中该家族的系统表征及其在热胁迫下的功能仍不清楚。黄瓜作为全球性重要蔬菜作物，对高温敏感，夏季高温常导致产量和品质严重下降。因此，基于高质量的CLv4.0参考基因组系统鉴定黄瓜F-box基因家族，并筛选耐热候选基因，对解析黄瓜耐热分子机制和分子育种具有重要意义。该研究论文发表在《Horticulturae》上。
研究人员首先从黄瓜Cucumber-DB数据库获取CLv4.0基因组蛋白质序列和注释信息，基于F-box结构域Pfam模型（PF00646、PF12937、PF13013）通过TBtools的Simple HMM Search筛选候选基因，并利用CDD、SMART和InterPro确认结构域完整性。随后利用MEGA12构建邻接（Neighbor-Joining）系统发育树，MEME鉴定保守基序，MCScanX分析重复事件并计算Ka/Ks，PlantCARE预测启动子顺式元件。表达分析基于Cucumber-DB公共转录组数据和qRT-PCR验证。功能验证采用农杆菌介导的瞬时转化，将CsFBX25、CsFBX77、CsFBX87在黄瓜子叶中瞬时过表达，并在42℃/32℃热胁迫下观察子叶黄化率和相对电导率（REC）。实验材料为黄瓜自交系9930，由北京市蔬菜研究中心提供。
3.1 鉴定、命名和分类：基于CLv4.0基因组，通过HMM搜索从蛋白质组中鉴定出175个高置信度CsFBX基因，按染色体位置命名为CsFBX1–CsFBX175。这175个基因不均匀地分布在7条染色体上，其中Chr3分布最多（43个）。根据C末端结构域组成，FBA亚家族（42个）最丰富，其次为FBOX（37个）、Kelch（25个）、LRR（23个）、PP2（15个）、Tub（9个）等。预测的蛋白质长度为119–1040个氨基酸，理论等电点大多低于7.0，多数定位于细胞核。
3.2 系统发育、基序和结构分析：通过MEGA12对175个全长CsFBX蛋白构建邻接系统发育树，将家族分成6个组（Group I–VI）。MEME分析鉴定出20个保守基序，其中基序2和基序7在绝大多数成员中存在，推测为F-box结构域的核心组分。基因结构分析显示CDS数量变异较大（1–17个），大部分基因含有非翻译区，表明该家族在基因结构层面发生了广泛分化。
3.3 共线性分析：种内共线性分析鉴定出9对片段重复（SD）和19对串联重复（TD），所有重复基因对的Ka/Ks值均小于1，表明受到纯化选择。串联重复对数显著多于片段重复，说明TD是驱动CsFBX家族扩张的主要机制。与西瓜、甜瓜、拟南芥和水稻的比较共线性分析显示，黄瓜与瓜类物种（西瓜146对、甜瓜136对）的直系同源基因对远多于与拟南芥（78对）和水稻（24对），其中有8个CsFBX基因在四个物种中均保留共线性，表现出高度保守性。
3.4 启动子顺式元件分布：提取所有CsFBX基因起始密码子上游2000 bp序列进行启动子顺式元件预测，发现大量与激素响应、光响应、胁迫响应及发育相关的元件。其中ABA响应元件ABRE在125个启动子中存在；茉莉酸响应元件CGTCA/TGACG也有分布；光响应元件G-box和Box 4出现频率较高；同时检测到低温和干旱响应相关元件，表明CsFBX基因可能受多种环境信号调控。
3.5 非生物胁迫下的表达谱：从Cucumber-DB获取涵盖冷、热、盐胁迫的转录组数据，以TPM>2为标准筛选出127个表达的CsFBX基因。热图分析显示，与冷胁迫相比，更大部分基因在热胁迫和盐胁迫下表现出明显的上调，提示这些基因可能参与热和盐胁迫响应网络。
3.6 瞬时表达研究基因功能：根据转录组数据选择并验证了3个候选基因。qRT-PCR显示CsFBX25、CsFBX77和CsFBX87均在热胁迫后显著诱导，但时相模式不同：CsFBX25表达持续上升至48 h（34.6倍），CsFBX77和CsFBX87在12 h达到峰值（分别2.0倍和16.5倍）。在黄瓜子叶中瞬时过表达CsFBX25或CsFBX77可显著降低热胁迫后的黄化面积和电解质渗漏，而CsFBX87无此效应，说明CsFBX25和CsFBX77可能通过维持细胞膜完整性参与黄瓜耐热响应。
讨论部分指出，F-box基因家族在植物非生物胁迫响应中具有广泛功能。本研究中CsFBX25和CsFBX77的过表达能维持质膜完整性，而CsFBX87尽管转录诱导强烈，但未观察到膜稳定性效应，推测其可能参与热胁迫更上游的信号转导。通过STRING数据库预测CsFBX25的潜在互作蛋白为Remorin蛋白，该蛋白参与质膜脂筏稳定和胁迫响应，据此提出CsFBX25可能通过Remorin相关途径调节膜稳定性，但该假说需要酵母双杂交、免疫共沉淀等实验验证。研究同时指出瞬时表达系统存在变异性和空间局限性，且未设置未浸润野生型对照，但空载体对照能解释农杆菌浸润和载体骨架的潜在影响。未来需通过稳定转基因或CRISPR/Cas9敲除突变体确认基因的内源功能。
研究结论：本研究首次对黄瓜F-box基因家族进行了系统、全基因组范围内的鉴定和表征。研究人员鉴定出175个CsFBX成员，并利用公共基因组和转录组数据，对其染色体定位、基因结构、理化性质、系统发育关系、重复模式、启动子顺式调控景观及热胁迫响应性进行了综合分析。分析表明，CsFBX家族在进化上整体保守，但单个成员在基因结构、调控元件分布和表达模式上存在显著分化。系统发育和重复分析显示，串联重复是驱动家族扩张的主要机制，纯化选择是家族进化的主导力量。转录组分析发现多个受热胁迫显著诱导的CsFBX基因，qRT-PCR验证了其表达动态，瞬时表达实验证明CsFBX25和CsFBX77在热胁迫下能维持膜完整性、减少电解质渗漏，提示它们可能与黄瓜耐热性相关。该工作为理解黄瓜CsFBX家族的功能提供了框架，并将CsFBX25和CsFBX77列为参与热胁迫的候选基因。
