巨型可移动元件推动了米曲霉（Aspergillus oryzae）的遗传多样性。米曲霉是一种传统上用于食品发酵的驯化真菌

《iScience》：Giant transposable elements drive genetic diversification in Aspergillus oryzae, a domesticated fungus traditionally used in food fermentation

　　亮点
- 在被驯化的稻曲霉（Aspergillus oryzae）中发现了巨型转座元件“星舰”（Starships）
- 在鉴定出的十种“星舰”类别中，有五种特定于稻曲霉
- 与发酵相关的“星舰”货物基因与工业应用相关
- “星舰”可能促成了稻曲霉的分化和驯化

摘要
最近在真菌中发现了能够携带货物基因并推动快速进化的巨型转座元件“星舰”。虽然已经研究了“星舰”在不同物种间的变异，但它们在相同物种内的变异中的作用仍不清楚。本研究探讨了稻曲霉中的“星舰”，这种真菌是从产生霉菌毒素的黄曲霉（Aspergillus flavus）分化而来，并随后被驯化用于日本酒、味噌和酱油等食品的发酵过程中。通过比较分析发现，“星舰”在驯化过程中的基因增减可能有助于确保食品生产的安全和稳定性。此外，即使携带相同类型的“星舰”的稻曲霉菌株，其基因组成也存在差异，这表明“星舰”的存在与特定菌株的用途有关。这些发现表明，“星舰”通过获取和重组货物基因促进了人工选择下的快速进化和多样化。

图形摘要

引言
移动遗传元件是可以在基因组内移动的DNA序列，与适应性进化有关。转座子是其中一种移动遗传元件，通常长度在100到10,000碱基对之间，能够转移到基因组的不同位置。它们最初在玉米中被发现，此后几乎在所有生物体中都被发现，包括动物、植物、真菌、细菌和古菌。转座子可以通过导致基因功能丧失或获得，或通过基因组重排来改变生物体的适应性。此外，已知在驯化过程中也有转座子的参与，选择出对人类有益的性状。在细菌中，还发现了一种称为整合接合元件（ICE）的大型移动遗传元件。与典型的转座子不同，ICE的长度在20到500千碱基对之间，携带多个影响细菌细胞表型的基因。像传统转座子一样，ICE也通过物种间的水平转移参与适应性状的产生，在基因组多样性和适应性进化中起重要作用。在真菌中，适应性进化是通过转座子引起的基因组变异来驱动的。最近，在丝状真菌亚门Pezizomycotina中发现了称为“星舰”的巨型转座元件（长度从15到700千碱基对不等）。这些元件在5′末端含有酪氨酸重组酶（YR）编码基因，称为“船长基因”，同时还包含一些称为“货物基因”的基因。据认为，YR能够将基因组元件从染色体上切除并重新插入其他染色体区域。“星舰”可能在基因组间的水平转移中发挥作用，并通过赋予抗重金属、甲醛的能力以及毒力等性状，提高宿主的适应性。尽管“星舰”促进了物种间适应性的进化，但它们在相同物种内菌株变异驱动的适应性进化中的作用仍大部分未被探索。

稻曲霉是一种被驯化的丝状真菌，在包括日本传统发酵工艺（如酒、酱油和味噌生产）在内的多种食品发酵过程中起着重要作用。稻曲霉是从产生致癌霉菌毒素黄曲霉素的黄曲霉分化而来的，并随后被驯化用于食品发酵。这一过程伴随着黄曲霉素产生的丧失和α-淀粉酶基因的复制。稻曲霉包含许多用于特定应用的工业菌株（如麸曲菌株 TK 菌株），这些菌株分为多个系统发育群，表现出高度的遗传多样性。然而，稻曲霉菌株多样性的基因组基础仍不清楚。最近在稻曲霉中预测了“星舰”元素的存在，但它们的功能尚未得到充分阐明。为了研究“星舰”与性状和基因组变异之间的关系，我们使用长读长测序技术对来自不同系统发育群的稻曲霉菌株进行了染色体级别的组装并进行比较分析。研究发现，稻曲霉中存在十类“星舰”元素，这些元素在稻曲霉和黄曲霉之间存在分布差异。在同一类中，某些“星舰”元素在稻曲霉和黄曲霉之间以及不同稻曲霉菌株之间也存在差异，表明这些多样性涉及稻曲霉的种间和种内变异。

结果
为了比较分析基因组变异与稻曲霉菌株异质性之间的关系，我们生成了染色体级别的组装。此前已经使用短读长测序技术对82个稻曲霉工业菌株进行了全面测序，并将其分为八个支系。由于支系D和H的菌株数据缺失，因此选择了属于支系B、A、C、G和E的五个菌株（TK-31、TK-34、TK-35、TK-41和TK-49）进行基因组测序（图S1A）。除了这些菌株外，还重新测序了已确定全基因组序列的RIB40菌株（属于支系F）作为对照。六个稻曲霉菌株的从头组装结果显示，基因组碎片长度在37.3至39.2百万碱基对之间（图S1B；表S1），BUSCO值表明其完整性很高（98.0%–98.5%）。特别是TK菌株的基因组序列比使用短读长技术获得的序列更加连续。TK菌株的染色体组装基于RIB40菌株与五个TK菌株之间的全染色体比对确定（图S1C）。大多数来自TK菌株的基因组片段仅与RIB40菌株的片段唯一对应（图S1C），表明稻曲霉菌株间的染色体结构几乎保守。然而，有些片段与RIB40菌株的多个片段对应，因此染色体末端区域（0.3–1.0百万碱基对）在TK菌株和RIB40菌株之间发生了交换（图S1C：黑色箭头）。通过同线性分析比较不同稻曲霉菌株的相同染色体区域（例如RIB40中的第4染色体和TK-35中的第4染色体；图S2A）发现，八个染色体区域（约10–290千碱基对）在各个菌株中的位置不同（图1A；区域1–8）。尽管这些区域在染色体上的位置不同，但在稻曲霉菌株间表现出高度的序列相似性，尽管某些菌株的部分序列存在差异（图1B）。在某些染色体区域中，一个菌株中包含两个或三个这样的区域，而有些菌株则没有这些区域（图1A）。值得注意的是，DUF3435结构域编码基因位于这些染色体的末端（图S2A）。最近的研究表明，DUF3435编码基因普遍存在于“星舰”中。因此，我们将含有DUF3435编码基因的染色体区域称为稻曲霉中的“星舰元素”（SEA1–8）。

图1 不同稻曲霉菌株染色体上的同源基因组区域
(A) 不同稻曲霉菌株（区域1–8）和TK-31中的非同源区域（区域9和10）的染色体图。彩色区域表示同源区域。
(B) 区域1–8及其侧翼区域的环状同线性图。红色箭头表示图1A中的染色体区域，黑色箭头表示其侧翼区域。星号表示片段末端。注意侧翼区域没有同源性。

稻曲霉中巨型转座“星舰”元素的分类
在上述研究中，我们主要关注了在不同菌株中位于不同染色体位置的区域，但这可能忽略了含有DUF3435编码基因的染色体区域。因此，我们全面探讨了含有DUF3435结构域（PF11917或IPR021842）的基因，并在六个稻曲霉菌株的基因组中鉴定出了66个DUF3435编码基因。系统发育分析将这66个DUF3435编码基因分为12个支系（图S2B）。属于12个支系中的10个支系的基因被纳入SEA1–8类别中，其中SEA4类别还包括另外两个DUF3435编码基因的支系（SEA4 #2和#3）。在TK-31菌株中发现了另外两个含有剩余DUF3435编码基因的染色体区域，这两个区域被命名为SEA9和SEA10类别（图1A）。最终，在六个稻曲霉菌株中鉴定出48个SEA（涵盖SEA1至SEA10类别）（图S3）。这些SEA的长度从6.3千碱基对到288.8千碱基对不等，平均GC含量为45.0%（表S2），尽管存在一些基因的缺失或插入，但归为同一SEA的区域在基因组上高度同源（图S3）。“星舰”元素的两端常含有末端反向重复序列（TIR）和直接重复序列（DR），这些序列有助于转座过程。因此，在鉴定的SEA中预测了这些序列的存在，并发现它们的序列因SEA类别而异（图S4），支持了这种分类。先前的研究表明，“星舰”元素的末端含有称为“船长”的DUF3435编码基因，因为它们介导了携带货物基因的“星舰”元素的转移。与这些发现一致，大多数鉴定的SEA在其末端含有DUF3435编码基因（图S3）。虽然某些SEA在SEA4中包含两个或三个DUF3435编码基因，但根据它们在区域中的位置，SEA4 #1支系的DUF3435编码基因被定义为“船长基因”（图S3）。根据DUF3435编码基因的系统发育关系对“星舰”元素进行了分类。使用星舰元素数据库starbase对DUF3435编码基因进行BLASTn搜索后发现，SEA1、SEA3、SEA6、SEA7和SEA8属于Prometheus家族，SEA4和SEA9属于Enterprise家族，SEA2属于Galactica家族，SEA5属于Phoenix家族。值得注意的是，SEA10与starbase中的元素没有序列相似性。

SEA功能的预测
为了研究SEA中基因的表达情况，我们使用三个稻曲霉菌株（RIB40、TK-35和TK-41）进行了RNA-seq分析，这些菌株包含了多种类型的SEA。虽然并非所有位于SEA中的货物基因都进行了转录表达，但它们的整体表达水平与其他染色体区域的基因相当（图S5A–S5C），表明与SEA相关的基因并未被转录沉默，可能具有生物学功能。为了预测这些SEA的功能，根据它们所编码蛋白质的结构对其包含的基因进行了注释（数据S1）。货物基因的组成在不同SEA类别间存在差异（图2A），表明SEA根据其类别具有不同的功能。在SEA中经常包含DUF3723、类似patatin的磷脂酶（PLP）、铁还原酶（FRE）和NUDIX结构域的基因（图2A）。在之前的研究中，Paecilomyces variotii的星舰元素HEPHAESTUS包含多种介导金属抗性的基因，而P. variotii和A. nidulans的星舰元素MITHRIDATE包含促进甲醛抗性的基因。然而，这些基因并未包含在SEA中。与“星舰”元素类似，我们发现SEA经常包含PLP基因和HET结构域的基因，这些基因与异核体不相容性有关（图2A）。因此，SEA可能参与调节在稻曲霉中检测到的异核体不相容性。此外，SEA还经常含有DNA结合蛋白和蛋白激酶（图2A），表明它们可能参与信号传递。

图2 SEA的功能预测
(A) 基于结构域的SEA基因频率热图。使用InterProScan预测了基因结构域，并量化了每个SEA类别中的基因频率。
(B) (左) 稻曲霉菌株中的α-淀粉酶基因。列出了amyA和amyB/C的基因ID和染色体位置。(右) 含有amyB/C的SEA的菌株的同线性图。红色和浅蓝色箭头分别表示DUF3435编码基因和α-淀粉酶基因。注意，在每个含有α-淀粉酶的SEA区域，侧翼区域一致地发现了转座子（jockey-like retrotransposon，黄色框；tnpa，紫色框；tao1，绿色框）。
(C) SEA3的同线性图。红色和黄色箭头分别表示DUF3435编码基因和糖基转移酶8（GT8）编码基因。GT8基因位于DUF3435编码基因的附近。在八个SEA3中，有四个含有GT8基因。（D）SEA6的序列同源性图。黄色箭头表示编码GH12纤维素酶或GH10木聚糖酶的基因。GH12和GH10基因仅存在于TK-49菌株的末端区域。尽管属于同一SEA的区域具有高度同源性，但在几个SEA对之间发现了包含不同基因的非保守区域（图S3）。为了探索Starship货物基因与A. oryzae工业应用之间的潜在关系，我们重点关注可能参与发酵过程的基因。有趣的是，一些SEA区域包含与食品发酵密切相关的α-淀粉酶基因（图2B）。A. oryzae的α-淀粉酶基因根据tnpA（序列号AB072434.1）这一假定的转座元件是否存在，被分为两组，即amyA和amyB/C，而SEA区域中包含的基因属于后者。amyB/C基因在各个菌株中的位置各不相同。特别是，在TK-41的SEA1和TK-35的SEA5中，这两个amyB/C基因的方向是不同的（图2B）。BLASTn分析显示，转座子tnpA和tao1（序列号AB021710.1）以及类似马戏团骑手的逆转录转座子（存在于果蝇中，类似于哺乳动物的LINEs）位于α-淀粉酶基因附近（图2B）。类似马戏团骑手的逆转录转座子位于不具有序列同源性的α-淀粉酶基因区域末端，表明amyB/C基因是通过类似马戏团骑手的逆转录转座子转移到特定SEA中的。为了检查A. oryzae菌株之间是否共享包含α-淀粉酶基因的区域，我们将TK菌株的短读长序列数据映射到相应的SEA序列上。TK-34、TK-31的SEA4_1和TK-35的SEA5中的amyB/C基因及其侧翼区域几乎没有克隆特异性序列，因此我们以TK-41的SEA1为例。通过与TK-41的SEA1进行映射分析，发现整个SEA1区域在G谱系内的菌株中是保守的（图3A），这表明SEA区域有助于增加同一谱系菌株中α-淀粉酶基因的拷贝数。此外，为了研究SEA1中的α-淀粉酶基因是否具有功能，我们删除了TK-41的SEA1中方向不同的两个α-淀粉酶基因（ΔTK41_S1-amy；图S6A），并检查了α-淀粉酶基因的表达和酶活性。由于α-淀粉酶基因的核苷酸序列几乎相同，RT-qPCR分析反映了TK-41中所有α-淀粉酶基因的总转录本。ΔTK41_S1-amy菌株的表达水平低于亲本菌株（图S6B）。此外，通过淀粉琼脂培养基上的晕圈形成测量的α-淀粉酶活性也低于亲本菌株（图S6C）。这些结果支持SEA1中的α-淀粉酶基因在转录上是活跃的并且具有功能的。

图3 A. oryzae中SEA存在与否的短读长序列映射数据
（A）将短读长序列（BioProject编号PRJDB7763）映射到TK-41的SEA1序列上。根据Watarai等人的研究，指示了每个菌株的工业用途。红色高亮/箭头代表编码DUF3435的基因。浅蓝色箭头代表α-淀粉酶基因，浅蓝色高亮区域代表α-淀粉酶基因及其侧翼区域。TK-41的SEA1包含类似马戏团骑手的逆转录转座子（黄色块）、tnpA转座子（紫色块）和tao1转座子（绿色块）。需要注意的是，在α-淀粉酶基因及其侧翼区域检测到的读取序列可能是由于基因组中存在多个相似序列所致。相比之下，仅G谱系中的TK-41具有覆盖整个α-淀粉酶基因及其侧翼区域的读取序列。（B）将短读长序列映射到TK-34的SEA3序列上。红色高亮/箭头代表编码DUF3435的基因。黄色高亮/箭头代表GT8基因。请注意，在A、C、G和H谱系中，读取序列映射到了包含GT8基因的区域。（C）将短读长序列映射到TK-49的SEA6序列上。红色高亮/箭头代表编码DUF3435的基因。黄色高亮/箭头代表GH10和GH12基因。请注意，在D、E和H谱系中，读取序列映射到了包含GH10和GH12基因的区域。此外，在某些菌株的SEA3中还检测到了编码糖基转移酶8（GT8）的基因（图2C）。为了研究A. oryzae菌株之间含有GT8编码基因的SEA3的保守性，进行了映射分析。GT8基因分布在A、C、G和H谱系的菌株中，同一谱系内的菌株之间这些元素的映射模式相似（图3B）。有趣的是，在具有GT8基因的52个菌株中，27个用于生产味噌，27个用于生产清酒，有些菌株同时用于这两种用途，这表明GT8基因的存在可能与这些发酵过程中的菌株用途有关。对SEA3中编码DUF3435的基因进行的系统发育分析显示，含有GT8基因的SEA3和不含GT8基因的SEA3之间有明显的谱系差异，而且这种系统发育树的拓扑结构与基于基因组规模SNP的菌株系统发育不同（图S7A）。认为A. oryzae中的GT8基因含有的SEA3是通过以下顺序事件转座的：(i) 含有GT8基因的SEA3的起源是C和G谱系的共同祖先。D、E、F和H谱系似乎失去了含有GT8基因的SEA3，而该元素在C和G谱系中得以保留（图S7A；蓝线）。根据图3B中的映射结果，本研究测序的所有C谱系菌株（包括TK-35）很可能都具有SEA3；因此，含有GT8基因的SEA3是垂直遗传到C谱系中的。(ii) 来自G谱系的含有GT8基因的SEA3水平转移到C谱系中（图S7A；绿线），导致相应谱系中出现了两个含有GT8基因的SEA3副本。(iii) 来自G谱系的C谱系中的额外含有GT8基因的SEA3又水平转移到A谱系中（图S7A；绿线）。这些结果表明，含有GT8基因的SEA3主要通过水平转移在A. oryzae菌株之间传播。此外，RNA-seq分析显示TK-35和TK-41中的GT8基因是表达的（图S5B和S5C），表明SEA3中的GT8编码基因在转录上是活跃的，并可能在A. oryzae中保留生物功能。为了研究水平转移的供体菌株和受体菌株之间SEA3中货物基因的表达是否不同，我们比较了假定供体TK-41（SEA3，G谱系）和受体TK-35（SEA3_2，C谱系）之间的表达谱型。共享的货物基因在两个菌株中都得到了转录表达（图S5D）。这一观察结果支持了SEA在水平转移过程中保留了转录活跃的货物基因的假设，这可能有助于A. oryzae的菌株多样化。此外，在TK-49的SEA6中发现了属于糖苷水解酶家族12（GH12）的假定的纤维素酶和属于糖苷水解酶家族10（GH10）的假定的木聚糖酶（图2D）。RT-qPCR分析检测到了GH10和GH12基因的表达，尽管GH12的转录本水平相对较低（图S5E），表明这些基因没有转录沉默，可能仍保留生物功能。GH10和GH12编码基因分布在D、E和H谱系的菌株中，以及非这些谱系的菌株（TK-24和TK-27）中（图3C）。有趣的是，这十个具有GH10和GH12基因的菌株中有八个用于酿造酱油，表明GT10和GH12基因在用于酿造酱油的菌株中得以保留。在SEA中，同一SEA类内的一些货物基因不同（图S3），这表明在根据特定应用选择菌株的过程中，SEA内相关基因的保留或丢失可能导致物种内的变异。

图4 线状真菌中10类SEA的分布
（A）基于BLASTn分析的线状真菌菌株中SEA数量的热图。具有超过30%“查询覆盖率”且含有DUF3435编码基因的基因组区域被认为表明存在SEA。（B）含有A. flavus特有基因的SEA2的序列同源性分析。比较了TK-41中的SEA2和A. flavus AF13（Chr1, 607,240–916,837 bp）中的Galactica。请注意，A. flavus中的NRPS基因及其侧翼区域在A. oryzae中不存在。（C）含有A. oryzae特有基因的SEA4和SEA9的序列同源性分析。分别比较了TK-35中的SEA4和A. flavus La3279（Chr4, 3,364,977–3,447,713 bp）以及TK-31中的SEA9和A. flavus AF13（Chr6, 3,335,948–3,376,442 bp）。请注意，NLR基因和甲基转移酶基因存在于A. oryzae中，但在A. flavus中不存在。
为了研究A. oryzae和A. flavus之间SEA区域的保守性，进行了序列同源性分析（图4B）。系统发育分析显示，A. flavus AF13菌株中SEA2和Galactica中的DUF3435编码基因在系统发育上接近（图S2B）；然而，在TK-41的SEA2和AF13的Galactica之间发现了具有不同基因内容的非保守区域（例如，A. oryzae中不存在的非核糖体肽合成酶（NRPS）编码基因G4B11_000237）（图4B）。与A. flavus AF13进行映射后发现，Galactica的整个序列在A. flavus菌株中是保守的；然而，在A. oryzae菌株中未检测到NRPS编码基因（图5A；黄色箭头和高亮）。短读长序列映射分析显示，含有NRPS的NRP簇在部分（A、B、F和G谱系）或完全（E谱系）中缺失（图5A）。根据SEA2中DUF3435编码基因的系统发育分析，认为SEA2是通过以下顺序事件在A. oryzae中转座的：(i) SEA2的起源是A. oryzae和A. flavus的共同祖先（图S7B；蓝线）。(ii) 在A. oryzae从A. flavus分化过程中失去了NRPS（图S7B；绿线），(iii) SEA2在A. oryzae菌株之间至少独立水平转移了四次。

图5 A. oryzae和A. flavus中SEA存在与否的短读长序列映射数据
（A）将短读长序列（BioProject编号PRJDB7763）映射到A. flavus AF13染色体1（607,240–916,837）的序列上。红色高亮/箭头代表编码DUF3435的基因。黄色箭头表示NRPS基因。请注意，在A. oryzae中没有将读取序列映射到NRPS基因及其侧翼区域。（B）将短读长序列映射到TK-35_SEA4的序列上。红色高亮/箭头代表编码DUF3435的基因。黄色高亮/箭头代表NLR基因。请注意，在A. flavus中没有将读取序列映射到含有NLR基因的区域。（C）将短读长序列映射到TK-31_SEA9的序列上。红色高亮/箭头代表编码DUF3435的基因。黄色高亮/箭头代表甲基转移酶基因。请注意，在A. flavus中，这些读段并未映射到含有甲基转移酶基因的区域。相比之下，A. oryzae的SEA4包含核苷酸结合寡聚化结构域（NOD）样受体（NLR）编码基因，而这些基因在A. flavus的SEA4中并不存在（图4C）。这些NLR编码基因具有以下结构：N端具有核苷磷酸化酶结构域（IPR000845），中央区域具有NB-ARC结构域（IPR002182），C端具有四聚肽重复序列（TPRs）（IPR019734）。对SEA4中的DUF3435 #1基因进行系统发育分析后发现，SEA4可能是通过以下顺序事件在A. oryzae中转移而来的（图S7C）：(i) SEA4起源于A. oryzae和A. flavus的共同祖先，并从A. flavus垂直遗传到A. oryzae菌株中（图S7C；蓝色和绿色线条）；(ii) 不含NLR基因的SEA4从A. flavus水平转移到D类群中；(iii) 在从A. flavus分化过程中，A. oryzae获得了NLR基因；(iv) 含有NLR基因的SEA4至少在A. oryzae的多个类群中独立水平转移了三次；然而，转移的方向尚未确定（图S7C）。NLR基因伴随着一个第三个DUF3435编码基因（DUF3435 #3），而在缺乏DUF3435 #3的区域中则没有NLR基因（图S3；SEA4），这表明它们可能与DUF3435 #3一起转移到SEA4中。将这些基因映射到A. oryzae TK-35后，发现它们在A. oryzae菌株中是保守的；然而，A. flavus菌株中并没有这些基因（图5B）。除了SEA4中的NLR基因外，还在SEA9中发现了一个甲基转移酶（IPR029063）编码基因，该基因也是A. oryzae特有的（图4C）。将它们映射到A. oryzae TK-31后发现，这个甲基转移酶基因在属于B类群的A. oryzae菌株中是保守的；然而，A. flavus菌株中并没有这个甲基转移酶基因（图5C）。对SEA9中DUF3435编码基因的系统发育分析表明，SEA9可能是通过以下顺序事件转移而来的（图S7D）：(i) SEA9起源于A. oryzae和A. flavus的共同祖先（图S7D；蓝色线条），(ii) SEA9仅保留在A. oryzae的B类群中，而在其他类群中丢失（图S7D；绿色线条），并且甲基转移酶基因是在从A. flavus分化过程中获得的（图S7D）。这些发现表明，最初存在于A. flavus中的SEAs主要是通过垂直遗传传递给A. oryzae，然后在A. oryzae菌株之间水平转移，SEAs通过基因的获得/丢失演化出了物种特异性的功能。

此外，对其他丝状真菌物种中SEA分布的调查研究还发现，SEA6存在于Monascus purpureus KUPM5中（图4A）。序列一致性分析进一步显示，A. oryzae菌株中的SEA6与M. purpureus的第3和第4号染色体对应区域具有高度序列相似性（图6A）。当比较A. oryzae和M. purpureus之间的整个转录本序列时，SEA6的转录本与其他基因相比具有更高的相似性（图6B），这表明SEA6是通过水平转移在这些物种之间传递的。此外，在M. purpureus的假定的SEA6区域中还发现了GH10和GH12基因（图6A）。这些基因也在TK-49菌株的SEA6中存在（图2D）。基于A. oryzae和M. purpureus中DUF3435编码基因的核苷酸序列进行的系统发育分析支持了以下顺序进化模型（图6C）：(i) 首先，C、D和E类群的祖先A. oryzae菌株获得了包含GH10和GH12基因的SEA6。(ii) 根据DUF3435编码基因的系统发育关系，SEA6从D类群的祖先菌株水平转移到H类群的菌株中。(iii) 含有GH10和GH12基因的SEA6也从D类群的祖先菌株水平转移到M. purpureus中。(iv) 在C类群和D类群分化之后，GH10和GH12基因在C类群中丢失。(v) 和 (vi) 从C类群中，不含GH10和GH12基因的SEA6分别水平转移到A/B类群和M. purpureus中。因此，含有GH10和GH12基因的SEA6的起源是通过多次转移在A. oryzae菌株之间以及从A. oryzae转移到M. purpureus中实现的。这些结果表明，最初存在于A. flavus中的SEAs主要是通过垂直遗传传递给A. oryzae，然后在A. oryzae菌株之间水平转移，并且SEAs通过基因的获得/丢失演化出了物种特异性的功能。

在其他丝状真菌物种中进行的SEA分布调查也发现，SEA6存在于Monascus purpureus KUPM5中（图4A）。序列一致性分析进一步显示，A. oryzae菌株中的SEA6与M. purpureus的第3和第4号染色体相应区域具有高序列相似性（图6A）。当比较A. oryzae和M. purpureus之间的完整转录本序列时，SEA6的转录本与其他基因相比具有更高的相似性（图6B），这表明SEA6是通过水平转移在这些物种之间传递的。此外，在M. purpureus的假定的SEA6区域中还发现了GH10和GH12基因（图6A）。基于A. oryzae和M. purpureus中DUF3435编码基因的核苷酸序列进行的系统发育分析支持了以下顺序进化模型（图6C）：(i) 首先，C、D和E类群的祖先A. oryzae菌株获得了包含GH10和GH12基因的SEA6。(ii) 根据DUF3435编码基因的系统发育关系，SEA6从D类群的祖先菌株水平转移到H类群的菌株中。(iii) 含有GH10和GH12基因的SEA6也从D类群的祖先菌株水平转移到M. purpureus中。(iv) 在C类群和D类群分化之后，GH10和GH12基因在C类群中丢失。(v) 和 (vi) 从C类群中，不含GH10和GH12基因的SEA6分别水平转移到A/B类群和M. purpureus中。因此，含有GH10和GH12基因的SEA6的起源是通过多次转移在A. oryzae菌株之间以及从A. oryzae转移到M. purpureus中实现的。

图6 A. oryzae和M. purpureus之间可能的水平转移

图注：
(A) A. oryzae和M. purpureus中SEA6的序列一致性图。比较了A. oryzae（TK-34和TK-49）和M. purpureus KUPM5菌株（登录号ASM2599979v1）中的SEA6基因组序列以及第3号和第4号染色体。红色箭头表示DUF3435编码基因，黄色箭头表示GH10或GH12基因。注意，GH10和GH12基因仅存在于A. oryzae TK-49和M. purpureus的第3号染色体中。
(B) M. purpureus KUPM5和A. oryzae TK-49之间的基因相似性。对TK-49中的基因开放阅读框序列进行了BLASTn搜索并与M. purpureus进行比对，计算出它们的同源性。每个图表代表与KUPM5的一次匹配。红色图表表示TK-49中的SEA6基因。
(C) A. oryzae中SEA6的转移进化模型。估计了最合理的进化模型，该模型最小化了基因获得和丢失事件的数量。仅考虑类群之间的水平转移，排除了菌株间的转移。(左) A. oryzae中DUF3435编码基因的系统发育树。根据推断的进化顺序，使用数字表示SEA6的起源（蓝色）、SEA6的水平转移（棕色）以及GH10和GH12基因的丢失（红色）。(右) 修改自图S1的A. oryzae菌株的系统发育树。构建了M. purpureus菌株和A. oryzae RIB40的系统发育树。蓝色/绿色线条表示SEA6保留在属于C、D和E类群的A. oryzae菌株中，并且该元素水平转移到了M. purpureus中。蓝色线条代表含有GH10和GH12基因的SEA6，而绿色线条代表不含GH10和GH12基因的SEA6。

讨论：
转座子可以通过修改基因组结构来响应特定环境，从而改变生物体的适应能力。在细菌中，转座子与适应性适应之间的关系已被广泛研究。ICE是一种在其区域内携带多个基因的转座子，有助于进化适应，例如抗生素抗性的获得。在真菌中，最近发现了一类功能类似的元素，称为Starships。在这项研究中，我们使用驯化的丝状真菌A. oryzae作为模型，发现由Starships介导的基因组结构变化与驯化和与工业应用相关的菌株内变异性有关。首先，我们生成了来自不同类群的六个代表性A. oryzae菌株的染色体级基因组序列（8-13个contigs）。对不同系统发育类群中的A. oryzae菌株的基因组结构进行比较分析后发现，基因组结构在很大程度上是保守的，这与先前的研究结果一致。值得注意的是，序列一致性分析显示A. oryzae中存在长度从10到290 kbp不等的Starship元素（SEAs）。在基于短读长的组装中，由于Starships的大小较大，检测它们颇具挑战性。然而，通过生成基于长读长的组装，我们能够在多个工业菌株中识别出Starship元素。根据DUF3435编码基因和 cargo基因的谱系，将SEAs分为10个类别。即使属于同一类别，这些元素在菌株间的染色体位置也有所不同，这表明SEAs主要通过水平转移和基因组内的易位在A. oryzae菌株之间传播。很少有研究详细考察同一物种内Starships的染色体位置。Gluck-Thaler等人最近报告说，Starships促进了真菌病原体A. fumigatus的菌株异质性，并观察到Starship元素的保守和可变染色体位置。此外，在A. fumigatus中，Starship元素的分布并不总是与菌株的系统发育相关。虽然A. fumigatus具有有性生命周期，但迄今尚未在该物种中发现有性周期。有一种称为tomokoji（或tmodane）的酿造技术（多重菌株的共培养），这种环境可能促进了Starship元素在菌株间的水平转移。此外，Urquhart等人证明Starship元素可以通过共培养在不同真菌物种之间转移。因此，在A. oryzae中，为了发酵目的进行的菌株内选择性选择可能导致同一物种内SEAs的存在/缺失以及在不同菌株间的染色体位置差异。

为了探讨SEAs是否仅存在于A. oryzae或在其他Aspergillus物种中也是保守的，我们进行了BLASTn搜索。在分析的Aspergillus物种中，发现SEAs仅分布于A. oryzae、A. flavus和A. sojae中。有趣的是，用于工业应用的驯化物种A. oryzae和A. sojae拥有的DUF3435编码基因比A. flavus更多，这与驯化物种通常含有更多Starships的趋势一致。SEA1、SEA3和SEA5仅存在于A. oryzae和A. sojae中，而不在它们的祖先物种A. flavus和A. parasiticus中（图4A），这表明这些区域可能是在驯化过程中在A. oryzae和A. sojae之间水平转移的。SEA2、SEA4、SEA7、SEA8和SEA9存在于A. flavus中（图4A），因此这些SEAs可能是从祖先物种A. flavus垂直遗传到A. oryzae的。例如，在SEA2/Galactica中，A. flavus菌株之间的序列同一性超过99%，表明其具有高度保守性。相比之下，在A. oryzae中观察到了重组事件和基因组区域或基因的部分删除，这表明SEAs在分化为A. oryzae的过程中发生了多样化。在A. oryzae中不存在有性周期，但在A. flavus中观察到镶嵌基因组结构，不同菌株之间的杂交可能导致Starship元素的系统发育独立分布。尽管如此，在A. oryzae中报告了由有性生殖导致的镶嵌基因组结构，但至今尚未在该物种中发现有性周期。有一种称为tomokoji（或tmodane）的酿造技术（多菌株共培养），这种环境可能促进了Starship元素在菌株间的水平转移。此外，Urquhart等人证明Starship元素可以通过共培养在不同真菌物种之间转移。因此，在A. oryzae中，为了发酵目的进行的菌株内选择性选择可能导致同一物种内SEAs的存在/缺失以及染色体位置的不同。

为了确定SEAs是否仅存在于A. oryzae或也在其他Aspergillus物种中保守，我们进行了BLASTn搜索。在分析的Aspergillus物种中，发现SEAs仅分布于A. oryzae、A. flavus和A. sojae中。有趣的是，用于工业应用的驯化物种A. oryzae和A. sojae拥有的DUF3435编码基因比A. flavus更多，这与驯化物种通常含有更多Starships的趋势一致。SEA1、SEA3和SEA5仅存在于A. oryzae和A. sojae中，而不在它们的祖先物种A. flavus和A. parasiticus中（图4A），这表明这些区域可能是在驯化过程中在A. oryzae和A. sojae之间水平转移的。SEA2、SEA4、SEA7、SEA8和SEA9存在于A. flavus中（图4A），因此这些SEAs可能是从祖先物种A. flavus垂直遗传到A. oryzae的。例如，在SEA2/Galactica中，A. flavus菌株之间的序列同一性超过99%，表明其具有高度保守性。相比之下，在A. oryzae中，同一SEA类别内观察到重组事件和基因组区域或基因的部分删除，这表明SEAs在分化为A. oryzae的过程中发生了多样化。SEA1在A. flavus中不存在，但在A. oryzae中唯一存在，该区域包含AogprK2/AO090166000020（图S3；SEA1），编码一种VI类G蛋白偶联受体，已知AogprK2负调节菌核的形成。在A. oryzae中，大多数菌株无法形成菌核，这可能是由于驯化的结果，而位于SEA1中的AogprK2可能是导致这一现象的原因之一。因此，Starships通常携带的 cargo基因在A. flavus中不存在但在A. oryzae中存在，可能是A. oryzae特有性状的基础。

SEAs包含多样化的cargo基因，这些基因在不同的SEA类别和菌株间有所不同（图S3；数据S1）。对三个A. oryzae菌株（RIB40、TK-35和TK-41）的RNA-seq分析显示，SEAs中的cargo基因与其他染色体区域的基因相比没有转录沉默（图S5A-S5C）。这表明SEAs中的一些cargo基因保持 transcriptionally active 状态，并可能保留生物学功能。比较分析显示，SEAs中既存在A. flavus特有的 cargo基因，也存在A. oryzae特有的 cargo基因。例如，虽然最终产物尚未确定，但在A. flavus的SEA2中存在的NRP（非核糖体肽）生物合成基因簇在A. oryzae菌株中部分或完全缺失（图4B和5A）。对DUF3435编码基因的系统发育分析表明，NRPS基因在A. oryzae从A. flavus分化或驯化过程中丢失（图S7B）。由于用于发酵的A. oryzae菌株被选为不产生黄曲霉素的菌株，类似的筛选过程可能也导致了毒素相关基因在分化或驯化过程中的消除。相比之下，A. oryzae特有的NLR基因存在于SEA4中，而甲基转移酶基因存在于SEA9中（图4C）。NLR基因与程序性细胞死亡有关，例如真菌中的异核体不相容性。异核体不相容性被认为在限制有害遗传元素（如转座子和真菌病毒）通过细胞融合在不同个体之间传播方面起着作用。在A. oryzae中已经检测到了异核体不相容性。在SEA4中，NLR基因在A. flavus中不存在；然而，在除D支系以外的多种A. oryzae菌株中都存在（见图5B、S3和S7C）。这些NLR基因可能增强异质识别，从而有助于基因组稳定性并促进持续酿造过程。然而，D支系菌株中SEA4相关NLR基因的缺失表明可能有其他因素也参与了异核体不相容性。此外，DUF3435 #3总是位于NLR基因附近（见图S3），这表明SEA4中存在其他Starship元素。这表明Starship元素可以作为其他转座元素的载体并促进适应性。甲基转移酶通常影响曲霉菌（Aspergillus sp.）中许多基因的转录，例如那些与次级代谢、有性/无性发育和毒力相关的基因。在SEA9中仅存在于A. oryzae中的甲基转移酶基因可能代表了B支系菌株的独特遗传特征（见图5C）。尽管B支系菌株用于酿酒，但其他支系中也存在酿酒菌株。对SEA9中编码甲基转移酶的基因进行功能分析可能有助于阐明B支系的特异性特征。这些发现表明，SEA的存在与否以及A. oryzae特有的载荷基因反映了在分化 and 驯化过程中有利于具有增强发酵和代谢产物生产能力菌株的选择压力。

接下来，分析了SEA中的载荷基因组成。对同一类SEA中的同线性分析显示大多数载荷基因是保守的；然而，某些基因在特定菌株的SEA中分布不规则。为了探讨SEA载荷基因与A. oryzae工业应用之间的关系，我们重点关注了α-淀粉酶、GT8、GH10和GH12基因，因为它们具有预测的发酵相关功能以及菌株特异性分布。例如，α-淀粉酶基因根据菌株的不同位于不同的Starship元素中，如SEA1、SEA3、SEA4和SEA5（见图2B）。在这些含有α-淀粉酶的区域中，始终发现类似“骑师”的逆转录转座子位于末端，可能介导了α-淀粉酶基因区域进入SEA（见图2B）。在细菌中，携带增强致病性或赋予抗生素抗性的基因的转座子被插入ICE（Intergenic Elements）中，这被认为有助于适应新的生态位。类似于细菌的ICE，在SEA中，通过转座子获得α-淀粉酶基因可能有助于A. oryzae适应酿造行业。A. oryzae拥有多个α-淀粉酶编码基因的拷贝，其拷贝数因支系而异（见图2B）。具体来说，G支系的TK-41有四个α-淀粉酶基因，其中两个拷贝位于SEA1中。A. oryzae中α-淀粉酶基因的拷贝数几乎取决于支系，因为其他G支系菌株与TK-41相似。删除TK-41中两个方向不同的α-淀粉酶基因会降低α-淀粉酶基因的表达和酶活性（见图S6），这表明SEA携带的载荷基因是功能性的。结合它们的菌株特异性分布，这些发现支持SEA中的功能性载荷基因可能有助于A. oryzae的驯化和菌株变异。除了TK-41，在其他α-淀粉酶基因位于SEA中的菌株中，α-淀粉酶基因的拷贝数在每个支系内也是保守的，这表明SEA有助于增加α-淀粉酶基因的拷贝数。用于酱油酿造的TK-49有两个α-淀粉酶基因拷贝，它们不在Starship元素中。在酱油酿造过程中，使用的是大豆而不是淀粉，因此高α-淀粉酶活性不是必需的。总体而言，Starship元素可能根据工业需求调节了α-淀粉酶基因的拷贝数。除了α-淀粉酶基因外，在同一类SEA中还发现了其他菌株特异性基因。在SEA3中，GT8基因特异性存在于A、C、G和H支系中（见图2C和3B）。值得注意的是，A、C和G支系包括用于制作味噌的A. oryzae菌株，在发酵过程中会遇到高盐浓度。对GT8编码序列的BLASTn分析显示其与编码半乳醇合成酶（EC 2.4.1.123）的基因具有相似性。半乳醇合成酶可以从肌醇和UDP-半乳糖合成半乳醇。在植物中，半乳醇被认为有助于耐受氧化、热和盐胁迫。尽管GT8基因在真菌中的功能尚不清楚，但这些基因可能与更广泛的适应发酵相关环境胁迫有关，包括盐胁迫。此外，通过RNA-seq分析显示（见图S5B和S5C），TK-35和TK-41的SEA3中的GT8基因是转录表达的，表明它们没有被转录沉默，可能保留了生物学功能。在SEA6中，TK-49菌株含有编码GH10木聚糖酶和GH12纤维素酶的基因（见图2D）。对TK-49基因组的映射显示GH10和GH12基因特异性存在于D、E和H支系中（见图3C）。这些支系的许多菌株用于酱油酿造，这表明GH10/GH12基因的存在可能与菌株应用有关。木聚糖酶和纤维素酶通常参与植物细胞壁多糖的降解，包括用于酱油生产的大豆成分。因此，GH10和GH12基因可能是有助于发酵相关性的候选因素。RT-qPCR分析检测到GH10和GH12基因的表达，尽管GH12转录本的水平相对较低（见图S5E），表明这些基因没有被转录沉默，可能保留了生物学功能。这些基因可能在用于酱油酿造的菌株中被优先保留；然而，这一假设需要实验验证。这些发现表明SEA通过人工选择获得有利基因，从而在其基因组分中产生了种内变异。与此可能性一致，RNA-seq分析显示SEA区域的载荷基因是转录表达的，并且相对于其他染色体区域的基因通常没有被沉默（见图S5A–S5C）。此外，在GT8包含的SEA3中，假定的供体菌株TK-41和受体菌株TK-35之间的基因在两个菌株中都有表达（见图S5D），这表明SEA载荷基因可以在水平转移后继续转录表达。有趣的是，在M. purpureus的第3和第4染色体上发现了与SEA6高度同源的序列（见图6A）。M. purpureus传统上用于发酵食品，如日本发酵豆腐（tofuyo）。在A. oryzae TK-49的SEA6区域中鉴定出的GH10和GH12基因也在M. purpureus的第4染色体上发现。SEA6中的DUF3435编码基因与A. oryzae菌株的单核苷酸多态性系统发育之间的比较表明，SEA6起源于C、D和E支系的根部，随后水平转移到M. purpureus，然后又水平转移到了M. purpureus（见图6C）。在实验室条件下，已经证明了A. oryzae的贫营养菌株与Monascus物种之间的菌丝融合。尽管A. oryzae和M. purpureus很少一起用于同一发酵过程，但两者都在东亚的发酵食品生产中常用。这种地理和生态上的重叠表明SEA6可能通过污染或其他环境相互作用在两个物种之间水平转移。这些发现与其他Starship元素的报告一致，证明了SEA能够在属之间进行水平传播。

我们提出了一个概念模型，总结了Starship在A. oryzae分化和驯化中的作用（见图7）。在A. flavus谱系中检测到了五个SEA类，其中一个祖先谱系分化出了A. oryzae。在从祖先A. flavus谱系分化为A. oryzae及其后续驯化过程中，又获得了五个额外的SEA类，而某些SEA似乎在个别菌株或支系中丢失了。此外，还获得了一些SEA载荷基因，包括甲基转移酶和NLR基因，而与霉菌毒素产生相关的SEA相关NRP基因则丢失了，从而产生了A. oryzae特有的遗传多样性。值得注意的是，与发酵相关的SEA载荷基因，包括α-淀粉酶、GT8和GH10/12基因也被获得，这些基因在特定工业应用的选择过程中促进了菌株变异。此外，SEA在A. oryzae菌株之间经历了基因组内转座和水平转移，SEA6似乎水平转移到了不同的属M. purpureus。总的来说，这些发现表明Starship元素作为遗传组分的获取、丢失和重组的载体，在A. oryzae的分化和驯化过程中产生了基因组多样性，并促进了菌株变异。在酵母中，这种多用途驯化的生物（如面包、酱油和葡萄酒），类似的综合基因组和表型分析已经报告了拷贝数变异和基因内容改变与驯化的驱动力有关。A. oryzae可能通过利用Starship元素作为遗传组分的载体，通过获取和重组载荷基因来适应环境生态位，从而促进了多用途应用的菌株变异。阐明SEA中未注释载荷基因的功能将为这一情景提供进一步证据。在这项研究中，我们证明了Starship元素及其载荷基因在A. oryzae和A. flavus之间以及A. oryzae菌株之间的多样性可能有助于A. oryzae的分化和驯化。我们的发现提出了一个真核模型，即大型移动遗传元件内的遗传组分多样性驱动了对特定生态位的适应。

图7：SEA在A. oryzae菌株中的传播概念模型

**研究局限性**：
我们的基因组比较分析揭示了A. oryzae菌株中Starship元素的存在/缺失；然而，由于只比较了每个支系的代表性菌株的基因组序列，因此无法充分评估支系内的变异。此外，虽然我们在这项研究中鉴定了十个Starship元素类别，但某些支系（例如D和H支系）的基因组序列尚未在染色体水平上进行测序，这表明可能存在未被发现的其他未表征的Starship元素类别。此外，尽管我们发现了Starship元素在不同系统发育支系之间的水平转移证据，但在确定供体和受体菌株之间的转移方向方面存在局限性。阐明Starship转移的方向需要综合的系统发育和群体水平分析，以及对A. oryzae的扩展长读长基因组测序，以便进行更全面的比较研究。

**资源可用性**：
有关进一步信息和资源的请求应联系主要联系人Jun-ichi Maruyama（[e-mail]）。

**材料可用性**：
本研究生成的真菌菌株和质粒将由主要联系人提供。

**数据和代码可用性**：
A. oryzae菌株的原始读段、基因组组装和注释数据已存入DDBJ，访问号为BioProject PRJDB37648（关键资源表）。A. oryzae菌株的RNA-seq数据可通过DDBJ BioProject PRJDB37768和PRJDB42568获取（关键资源表）。•本研究未报告原始代码。•如需重新分析本研究中报告的数据，可向相关负责人请求获取任何额外信息。

致谢
本研究得到了日本学术振兴会（JSPS）KAKENHI项目（项目编号18H02123至J.M.、24H00496至J.M.、23H04547至J.M.以及25KJ1154至Y.H.）、JST SPRING项目（项目编号JPMJSP2108至Y.H.）、札幌生物科学基金会（资助J.M.）和Sasakawa科学研究基金（资助Y.H.）的支持。此外，该工作还得到了NIBB协作研究计划（项目编号18-468、19-439、20-405和21-315）的支持。我们感谢H. Asao、A. Akita和M. Matsumoto在NIBB进行的下一代测序工作，同时也感谢Editage（www.editage.com）提供的英语语言编辑服务。

作者贡献
Y.H.、T.K.、S.S.和J.M.共同策划并设计了本研究。Y.H.、T.K.、Y.C.、K.N.和K.Y.负责实验操作。Y.H.、K.T.、Y.C.、K.Y.、S.S.和J.M.完成了生物信息学分析。所有作者均签署了手稿。

利益声明
作者声明无利益冲突。

STAR★
方法
关键资源表

试剂或资源
来源标识符

抗体
大肠杆菌DH5α
Thermo Fisher Scientific
目录号：EC0112

化学品、肽和重组蛋白
蛋白酶K溶液
KANTO CHEMICAL CO., INC.
目录号：34060-96

牛胰蛋白酶A
NACALAI TESQUE, INC.
目录号：30141-14

吡啶硫胺盐酸盐
Sigma-Aldrich
目录号：534-64-5

关键商业检测试剂
QIAGEN Genomic-tips
目录号：10223

短读长消除试剂盒XLP
Pacific Biosciences
目录号：SS-100-111-01

牛津纳米孔连接测序试剂盒
Oxford Nanopore Technologies
目录号：SQK-LSK109

Isogen
NIPPON GENE
目录号：311-02501

RNeasy mini试剂盒
QIAGEN
目录号：74104

Qubit? 1X双链DNA高灵敏度（HS）检测试剂盒
Thermo Fisher Scientific
目录号：Q33231

PrimeScript? RT试剂盒（含gDNA Eraser，Perfect Real Time）
TaKaRa
目录号：RR047

ATB Green? Premix Ex Taq? II（Tli RNaseH Plus）
TaKaRa
目录号：RR820S

PrimeSTAR? HS DNA聚合酶
TaKaRa
目录号：R010A

In-Fusion? Snap Assembly Master Mix
TaKaRa
目录号：638947

KOD FX Neo
TOYOBO
目录号：KFX-201

SmaI
TaKaRa
目录号：1085

ABst1107
ITaKaRa
目录号：1028

存储数据
RIB40和TK菌株的長讀序列数据
DDBJ: PRJDB37648

TK菌株的短讀序列数据
Watarai等人，DDBJ: PRJDB7763

A. oryzae RIB40菌株在液体培养基中的RNA-seq分析数据
DDBJ: PRJDB37768

A. oryzae菌株在PD琼脂培养基中的RNA-seq分析数据
DDBJ: PRJDB42568

实验模型：生物体/菌株
A. oryzae：菌株RIB40
Machida等人
NBRC 100959

A. oryzae：菌株TK-31
Watarai等人

A. oryzae：菌株TK-34
Watarai等人

A. oryzae：菌株TK-35
Watarai等人

A. oryzae：菌株TK-41
Watarai等人

A. oryzae：菌株TK-49
Watarai等人

A. oryzae：ΔTK41_S1-amy菌株
本研究

N/A

寡核苷酸
本研究中使用的寡核苷酸列表见表S3

N/A

重组DNA
pRGEgTK41_TE1amy2ND
本研究

N/A

软件和算法
MinKNOW v23.04.3
Oxford Nanopore Technologies
N/A

Tapestry v1.0.1
Davey等人
https://github.com/johnomics/tapestry?tab=readme-ovpy

GenomeViz v0.4.4
Shimoyama
https://github.com/moshi4/pyGenomeViz

Fastp v0.20.1
Chen等人

RRID: SCR_016962
HISAT2 v2.2.1
Kim等人

RRID: SCR_015530
Samtools v1.14
Li等人

RRID: SCR_002105
FeatureCounts v2.0.1
Liao等人

RRID: SCR_012919
Hifiasm v0.19.5-r587
Cheng等人

RRID: SCR_021069
Funannotate v1.8.6
Palmer和Stajich
RRID: SCR_023039

Porechop v0.2.4
Bonenfant等人

RRID: SCR_016967
NanoFilt v2.8.0
Coster等人

RRID: SCR_016966
Flye v2.8.0-b1695
Lin等人

RRID: SCR_017016
Pilon v1.24
Walker等人

RRID: SCR_014731

AntiSMASH真菌版本7.0
Blin等人

RRID: SCR_022060
BUSCO v5.4.4
Manni等人

RRID: SCR_015008

InterProScan v5.22-61.0
Jones等人

RRID: SCR_005829
BWA v0.7.18-r1243-dirty
Li等人

RRID: SCR_010910
GATK v4.2.0.0
McKenna等人

RRID: SCR_001876

RAxML-NG v1.2.2
Kozlov等人

RRID: SCR_022066
MUMmer v3.1
Kurtz等人

RRID: SCR_018171
Circos v0.69-6
Krzywinski等人

RRID: SCR_011798
Mafft v7.520
Katoh等人

RRID: SCR_011811
FigTree v1.4.4
爱丁堡大学；Rambaut实验室

RRID: SCR_008515
R v4.2.2
R Core Team
https://www.R-project.org/ggplot2

Wickham
RRID: SCR_014601

chromoMap
Anand和Rodriguez等人
https://lakshay-anand.github.io/chromoMap/index.html

其他
PacBio
Pacific Biosciences
N/AMinION Mk1B

Oxford Nanopore Technologies
https://nanoporetech.com/ja/products/sequence/minion#gns.searchValue=mk1b&searchf1.value=Store&searchq.query=mk1b

Illumina Novaseq 6000测序系统
Illumina
https://www.illumina.com/systems/sequencing-platforms/novaseq.html; RRID: SCR_016387

Qubit 4荧光计
Thermo Fisher Scientific
目录号：Q33226

Multi-beads Shocker
Yasui Kikai
目录号：MB455U

Thermal Cycler Dice? 实时系统IV
TaKaRa
目录号：TP1000

实验模型和研究参与者详情
本研究使用了A. oryzae菌株RIB40、TK-31、TK-34、TK-35、TK-41和TK-49。

方法详情
A. oryzae的基因组DNA提取
为了提取基因组DNA，将分生孢子接种到DPY培养基（20 g/L右旋糖、5 g/L酵母提取物、10 g/L多肽、5 g/L KH2PO4和0.5 g/L MgSO4·7H2O，pH 5.5）中，并在30°C下孵育1天。孵育1天后，将其迅速冷冻在液氮中。随后，使用Multi-beads Shocker（Yasui Kikai，大阪，日本）将冷冻的菌丝匀浆。根据制造商的说明，使用QIAGEN Genomic-tips（QIAGEN，Venlo，荷兰）从匀浆的菌丝中提取RIB40的基因组DNA，然后使用PacBio SMRT测序（HiFi）方法（Pacific Biosciences，Menlo Park，CA，美国）进行测序。对于使用MinION（Oxford Nanopore Technologies，英国）的测序，TK菌株的基因组DNA的提取方法与前述类似，但稍作修改。将匀浆的菌丝悬浮在提取缓冲液（0.5% SDS、50 mM EDTA和0.1 mg/ml蛋白酶K，pH 8.0）中，并在60°C下孵育30分钟。离心去除杂质后，上清液用苯酚/氯仿/异戊醇（25:24:1）处理两次，再用氯仿/异戊醇（24:1）处理一次。将提取物与4 μL 5 mg/ml的RNase A溶液混合并在37°C下孵育1小时。基因组DNA用乙醇沉淀，沉淀物用玻璃棒收集，用70%乙醇洗涤，然后溶解在100 μL的TE缓冲液中。使用Qubit 4荧光计（Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，美国）测量DNA浓度。

基因组测序
对于RIB40菌株的基因组测序，根据制造商的说明使用SMRTbell Template Prep Kit 3.0制备HiFi文库，并使用PacBio Sequel IIe平台进行测序。对于五个TK菌株的基因组测序，使用Short Read Eliminator Kit XL（Pacific Biosciences）去除短DNA片段。文库制备和测序使用Oxford Nanopore Ligation Sequencing Kit（SQK-LSK109；Oxford Nanopore Technologies）、MinION流动细胞（R9.4.1；Oxford Nanopore Technologies）和MinION Mk1B（Oxford Nanopore Technologies）进行，参数按制造商说明设置。碱基调用和质量控制使用MinKNOW v23.04.3进行。

RNA测序
为了进行基因组注释，将RIB40菌株在DPY液体培养基中在30°C下孵育1天。将冷冻的菌丝使用multi-bead shocker（Yasui Kikai，大阪，日本）匀浆。为了确认SEAs中的基因表达，将RIB40、TK-35和TK-41菌株在覆盖有玻璃纸的PD培养基中在30°C下培养2天。收获的菌丝冷冻后使用研钵和杵匀浆。使用Isogen（NIPPON GENE，东京，日本）提取总RNA，并使用RNeasy Mini Kit（QIAGEN）按制造商说明进行纯化。文库制备和测序由Novogene（北京，中国）商业完成。对于RIB40、TK-35和TK-41菌株的RNA-seq数据分析，使用fastp v0.20.1对序列读段进行修剪和过滤，然后将过滤后的读段使用HISAT2 v2.2.1映射到相应的A. oryzae菌株的基因组序列上。输出SAM文件转换为BAM文件，并使用Samtools 1.14进行索引。使用featureCounts v2.0.1计算每个基因的读段数量，并计算每百万转录本（TPM）。Log10(TPM + 1)值以热图形式显示。

基因组组装和注释
使用PacBio测序获得的HiFi长读段，使用hifiasm v.0.19.5-r587和默认设置生成A. oryzae RIB40的从头组装。排除了错误组装的短Contigs（小于10-kb的序列和重复序列）。使用Funannotate pipeline v1.8.16和InterProScan v5.22-61.0及默认参数对基因组组装进行注释。使用porechop v0.2.4对五个TK菌株（TK-31、TK-34、TK-35、TK-41和TK-49）的长读段进行适配子修剪和quality过滤，然后使用flye v2.8.3-b1695和nano-raw选项生成从头组装。使用Pilon v1.24使用相应的短读段（BioProject编号PRJDB7763）对组装进行精细化。TK菌株的基因组组装也使用Funannotate pipeline进行注释，但不包括RNA测序数据。使用antiSMASH真菌版本7.0预测生物合成基因簇（BGCs）。使用BUSCO v.5.4.4和fungi_odb10数据集评估组装的完整性和基因注释。使用Tapestry包v1.0.1的weave软件和-d 30以及-t TTAGGGTCAACA参数识别端粒重复序列。

为了识别DUF3435基因，使用了A. flavus AF13（Acc. No. GCA_014117485.1）、A. flavus CA14（Acc. No. GCA_014784225.2）、A. flavus NRRL3357（Acc. No. GCA_014784225.2）、A. flavus NRRL21182（Acc. No. GCA_009017415.1）、A. niger CBS117618（Acc. No. GCA_009176385.1）、A. fumigatus Af293（Acc. No. GCA_000002655.1）、A. parasiticus CBS117618（Acc. No. GCA_009176385.1）、A. nidulans FGSC A4（Acc. No. GCA_000011425.1）和A. luchuensis IFO4308（Acc. No. GCA_000011425.1）的蛋白质序列。A. flavus La3279（Acc. No. GCA_030515275.1）、A. sojae NBRC4239（Acc. No. GCA_000226655.2）和A. sojae SMF134（Acc. No. ASM827498v1）的蛋白质序列无法公开获取；这些菌株使用Funannotate pipeline和它们的基因组序列进行注释。在PF11917或IPR021842的存在下检测到了编码DUF3435的基因。

系统发育分析
为了分析A. oryzae RIB40和TK菌株之间的系统发育关系，构建了A. oryzae和A. flavus的系统发育树。本研究使用了35个A. oryzae和A. flavus菌株的公共可用的短读基因组。短读基因组使用fastp进行适配子修剪和质量过滤。接下来，使用BWA-MEM将过滤后的读段映射到A. flavus Afla-Guard（Acc. No. ASM1289687v1），并使用SAMtools将sam文件转换为bam文件。使用GATK v4.2.0的“Haplotype Caller”选项调用和过滤SNP到Afla-Guard。使用RAxML-NG和GTR+G+ASC_LEWIS模型以及100次自助重复分析系统发育关系。

为了分析Monascus purpureus的系统发育关系，使用MAFFT连接和比对beta-tubulin、beta-actin和calmodulin基因的核苷酸序列，并使用RAxML-NG进行系统发育分析。

为了构建同一SEA类中DUF3435基因的系统发育树，使用BLASTn分析在NCBI数据库中搜索代表菌株中的DUF3435基因的核苷酸序列。使用MAFFT进行比对，并使用RAxML-NG进行系统发育分析。

全基因组比对
为了确定A. oryzae TK-31、TK-34、TK-35、TK-41和TK-49基因组与RIB40基因组之间的同源性，使用MUMer aligner v3.1进行比对。简要来说，使用“大约为1的数值表示相应区域的存在。在A. oryzae与其他丝状真菌物种之间比较SEAs

为了搜寻其他丝状真菌物种中的SEAs，使用了代表性菌株的十个SEA的完整序列（RIB40的SEA1、RIB40的SEA2、RIB40的SEA3、RIB40的SEA4_1、TK-41的SEA5、TK-34的SEA6、TK-34的SEA7、TK-35的SEA8、TK-31的SEA9以及TK-31的SEA10），通过NCBI BLASTn搜索，并设置“organism”选项为“A. oryzae (taxid:5062)”、“Aspergillus flavus (taxid:5059)”或排除“A. oryzae和A. flavus”。在“Query Cover”中BLASTn命中率超过30%且包含DUF3435编码基因的基因组区域被视为存在SEAs的迹象。

**A. oryzae与M. purpureus之间的基因水平转移分析**

为了预测SEA6的水平转移，通过NCBI BLASTn分析将A. oryzae TK-49中包含SEA6的整个基因的核苷酸序列与M. purpureus KUPM5的相应序列进行了比较，E值阈值为1e-50。对于BLASTn命中结果，绘制了点状图（x轴：基因长度（bp）；y轴：相似度（%））。使用pgv-mummer工具可视化了基因组同线性块。被识别为在TK-49和M. purpureus之间水平转移的假想基因以红点显示。

**SEAs中基因的功能研究**

为了分类SEAs中包含的基因，使用InterProScan预测了它们的结构域。统计了具有相同结构域的基因数量。然后，可视化了许多频繁出现的结构域（DUF3435 [IPR021842或PF11917]、DUF3723 [IPR022198或PF12520]、Patatin样磷酸脂酶（PLP）[IPR002641或PF01734]、Ferric_reduct [IPR013121, PF08030或IPR013130]和NUDIX [IPR015797, PF00293或IPR000086]、异核体不相容相关结构域（WD40 G-beta重复序列 [IPR015943, IPR001680, PF00400, IPR020472或IPR019775]、NACHT [PF05729, IPR007111或IPR031359]和HET [PF06985或IPR010730]、信号传导相关结构域（DNA结合蛋白；Zinc finger [IPR007087, IPR013087或PF13920]、Zn(2)Cys(6)真菌类型 [PF00172或IPR001138]、RING [IPR017907, IPR013083, IPR001841, PF13923, PF00097或PF13445]、MADS [IPR002100]、Homedomain样结构域 [IPR009057, PF00046或IPR001356]、F-box [IPR001810]、Pkinase [IPR011009, PF17667, IPR000719, PF00069或IPR008271]以及其他结构域（Methyltransferase [PF13489, PF13649, PF08241, PF13847, PF08242]和Arrestin [IPR024391或PF02752]、Ankyrin重复序列 [PF13606, PF13857, PF00023, PF12796, PF13637或IPR002110]、DnaJ [PF00226或IPR001623]、Helicase [IPR014001, PF00271或IPR001650]和α-淀粉酶 [GH13; IPR015340, PF09260, IPR006046或PF00128]），并使用R包ggplot2生成热图。

**DNA操作**

使用大肠杆菌DH5α菌株进行DNA操作。使用PrimeSTAR? HS DNA聚合酶（TaKaRa Bio，日本大津）进行PCR以构建质粒。使用In-Fusion HD克隆试剂盒（TaKaRa Bio，日本大津）进行质粒构建。基因组PCR使用KOD FX Neo（TOYOBO）进行。本研究中使用的引物列在表S3中。

**敲除菌株的构建**

从pRGE-gwAup中扩增U6启动子及α-淀粉酶基因5'-侧翼区域的靶序列，使用SmaIIF1-PU6-F2nd/gTK41_TE1_amy-PU6-R1st引物，并与SmaI消化的pRGE-gRT6连接，得到基因组编辑质粒pRGEgTK41_TE1amy1st。从pRGE-gwAup中扩增U6启动子及α-淀粉酶基因3'-侧翼区域的靶序列，使用Bst-PU6F/gTK41_TE1_amy-PU6-R2nd引物；同时从pRGEgwAup中扩增引导RNA和U6终止子，使用guide-TU6-F/Bst-TU6R引物。这两个片段与Bst1107I消化的pRGEgTK41_TE1amy1st连接，得到基因组编辑质粒pRGEgTK41_TE1amy2nd。按照先前的方法对A. oryzae TK-41菌株进行转化。使用基因组编辑质粒pRGEgTK41_TE1amy2nd和寡核苷酸TK41_TE1_amyDN-ssDD-F进行转化。预培养使用Dextrin-peptone（DP）培养基（20 g/L葡聚糖，10 g/L多肽，5 g/L KH2PO4，0.5 g/L MgSO4·7H2O）。选择转化体时使用Czapek-dox（CD）培养基（3 g/L NaNO3，2 g/L KCl，1 g/L KH2PO4，0.5 g/L MgSO4·7H2O，0.002 g/L FeSO4·7H2O，以及20 g/L山梨醇 [pH 5.5]）。为了选择携带吡哆胺抗性ptrA标记质粒的菌株，添加0.1 μg/ml吡哆胺。为了从转化体中去除基因组编辑质粒，在CD培养基中替换山梨醇为葡聚糖。

**RT-qPCR分析**

使用改良的DPY培养基（10 g/L马铃薯淀粉，10 g/L多肽，5 g/L酵母提取物，5 g/L KH2PO4，0.5 g/L MgSO4·7H2O，pH 5.5）培养TK-41。为了检测TK-49中GH10基因的表达，使用含有玉米芯木聚糖而非马铃薯淀粉的改良DPY培养基。为了检测TK-49中GH12基因的表达，使用含有羧甲基纤维素而非马铃薯淀粉的改良DPY培养基。从30°C下的液体培养物中收集菌丝，立即用液氮冷冻。之后，使用Multi-beads Shocker（Yasui Kikai，日本大阪）对冷冻的菌丝进行匀浆。提取总RNA，并使用PrimeScript? RT试剂盒与gDNA Eraser（Perfect Real Time）（TaKaRa）进行cDNA合成。RT-qPCR使用TB Green? Premix Ex Taq? II（Tli RNaseH Plus）（TaKaRa）和Thermal Cycler Dice? Real Time System IV（TaKaRa）进行。RT-qPCR使用的引物列在表S3中。

**α-淀粉酶活性的测定**

为了测定α-淀粉酶活性，将分生孢子悬浮液（5.0 × 10^4/5 μL）点涂在含有改良淀粉的DPY琼脂培养基上，并在黑暗中于30°C下培养3天。培养后，用碘液染色平板，然后测量晕圈大小。

**定量与统计分析**

使用Student’s t检验计算p值。p值小于0.05被认为表示存在显著差异。? p < 0.05，*** p < 0.001。

**补充信息（3）**

下载全部内容：
- PDF（2.51 MB）：文档S1（图S1–S7和表S1–S3）
- 电子表格（84.94 KB）：数据S1（SEAs中的基因列表，与图S3和S5相关）
- PDF（218.27 KB）：数据S2（与图S6A相关的未裁剪DNA凝胶电泳图像）