浦肯野细胞到达浦肯野细胞层协调小脑叶化及其时间顺序

《iScience》：Purkinje cell arrival at the Purkinje cell layer orchestrates cerebellar foliation and its temporal sequence

　　

亮点•PC 到达 PCL 确保了足够的 SHH 递送至 GCP 以促进叶状形成•即使 PC 从 PCL 发生轻微偏离也无法支持 GCP 增殖和叶状形成•PC 单层形成的分叶特异性时间顺序是顺序性叶状形成的基础•DAB1 仅在 PC 到达 PCL 位置之前是必需的摘要小脑叶状形成以刻板的方式进行，但调节其时间顺序的发育机制仍不清楚。在 reeler 和 yotari 小鼠中，异常的浦肯野细胞（PC）定位和叶状形成缺陷共存，但它们的因果关系仍未解决。在这里，利用时间控制的、PC 特异性的 DAB1 删除，我们研究了 PC 迁移与叶状形成的关系。我们表明，出生后 DAB1 的缺失破坏了 VI/VII 分叶的 PC 定位和叶状形成，并且即使是 PC 从浦肯野细胞层（PCL）的轻微移位也会减少颗粒细胞前体（GCP）的局部增殖，而补充刺猬信号（SHH）可以挽救这些叶状形成缺陷。此外，我们发现 PC 到达 PCL 的时间在不同分叶间存在差异，并伴随有分叶特异性的 GCP 增殖峰值。这些发现确定了 PC 到达 PCL 是一个使有效 SHH 信号传导成为可能的发育过程，从而促进叶状形成，并表明 PC 到达时间的空间差异协调了小脑叶状形成的时间顺序。图示摘要引言在所有哺乳动物中，大脑的结构以高度组织化的褶皱为特征——在许多物种的有沟回新皮层中表现显著，并在水准方向的小脑小叶中得以保守。在小脑中，叶状以高度刻板、物种保守的顺序出现，产生成熟的层状小脑皮层——这一发育过程统称为叶状形成。然而，产生小脑折叠精确时间和空间模式的发育原则仍未完全理解。浦肯野细胞（PC）和颗粒细胞（GC）是小脑正常发育和功能所需的两种基本神经元类型。在小鼠发育小脑中，PC 产生于小脑原基的脑室区。它们在胚胎第（E）11 天至 E13 天之间进行最后一次有丝分裂，随后移出脑室区。离开脑室区后，PC 在 Reelin 信号的控制下向皮层表面迁移，并暂时形成多层 PC 板（PCP）。在出生后早期，这层多层结构逐渐解析为特征性的 PC 单层。随着 PC 迁移的进行，小脑叶状形成在相同的发育窗口内启动。小脑叶状形成的主要驱动力是外部颗粒层（EGL）中颗粒细胞前体（GCP）的增殖。GCP 增殖受到 PC 分泌的刺猬信号（SHH）的强烈促进，而 SHH 信号的缺失显著减少 GCP 增殖并导致严重的叶状形成缺陷。大脑形态发生的一个特别有趣方面是折叠以非常顺序的方式继续进行——无论是在有沟回新皮层还是小脑中。例如，在人类新皮层中，外侧裂首先出现在第 16 孕周（GW）左右，随后是中央沟等主沟出现在 GW 25，次级和三级沟在妊娠最后 2 个月发育。在小鼠小脑蚓部，主要裂隙在胚胎后期开始形成，而额外的裂隙仅在出生后出现，其中中央区（VI/VII 分叶）的裂隙形成起始较晚。为了探索这种顺序性叶状形成的机制，Legue 等人观察到 VI/VII 分叶表现出较晚的出生后 GCP 增殖峰值，而 Lawton 等人发现，注定在出生后发生次级折叠的分叶相对于核心经历了不成比例的出生后表面积扩张。这些发现揭示了较晚叶状形成的重要相关性，但驱动延迟 GCP 增殖和表面积扩张的上游机制仍未确定。关于什么控制裂隙形成的时间顺序这一根本问题仍未得到解答，且尚未出现关于顺序性叶状形成的统一机制解释。Reelin 是一种大型分泌糖蛋白，在脑发育过程中发挥关键作用，最显著的是控制神经元迁移和层状结构的建立。这些发育作用通过 DAB1 介导，DAB1 是 Reelin 受体 LRP8 (ApoER2) 和 VLDLR 下游激活的胞内接头。在小脑发育过程中，Reelin 表达首先在菱唇来源的核过渡区神经元中检测到，随后在 EGL 的 GCP 中检测到，而 Dab1 主要表达在 PC 中。Reelin 信号受损的小鼠突变体，如 reeler 和 yotari（一种 Dab1 基因敲除突变体），通常表现出异位 PC 深部定位以及明显的叶状形成缺陷。然而，异常的 PC 定位如何影响裂隙形成的起始和进展，PC 错位在多大程度上扰乱 GCP 增殖，以及 Reelin/Dab1 突变小脑中的叶状形成缺陷是否仅由异常 PC 迁移解释，这些仍未知。此外，PC 迁移需要 DAB1 的精确发育窗口尚未确定。因此，连接 Reelin 信号、PC 迁移和小脑叶状形成的统一机制联系仍不清楚。在本研究中，我们着手阐明 PC 迁移如何控制小脑叶状形成，并揭示 Dab1 对该过程的阶段特异性贡献。通过建立时间精确的 Dab1 条件性敲除（cKO）系统，我们揭示了两个关键机制。首先，PC 到达 PC 层（PCL）是一个关键的调控步骤，控制 GCP 扩张所需的 PC 来源线索的可用性。其次，PC 到达时间在不同分叶间的内在差异提供了一个上游机制，可以解释顺序性裂隙形成。总之，这些发现建立了一个统一的框架，连接了 Reelin-DAB1 信号、PC 迁移动力学和小脑叶状形成的时间模式。结果出生后 Dab1 的缺失局部破坏 PC 排列和叶状形成由于 reeler 和 yotari 小鼠中严重的叶状形成缺陷源于胚胎期形成主要裂隙，Reelin-DAB1 通路在出生后小脑裂隙形成和重塑中的作用仍不清楚。为了解决这个问题，我们使用腺相关病毒（AAV）介导的 Cre 表达在出生后消融 Dab1。AAV-CAG-EGFP-P2A-Cre 在第 1 天（P）双侧注射到 Dab1fl/fl 和 Dab1+/fl 同窝（Dab1 flox 小鼠）的侧脑室中，小脑在 P8 固定。EGFP 作为 Cre 转染细胞的标记物。免疫染色显示，大多数 EGFP 阳性细胞是 Calbindin 阳性的 PC，而一小部分由内部颗粒层（IGL）中的 BLBP 阳性星形胶质细胞和 Nestin 阳性 Bergmann 胶质细胞（BG）组成，（图 S1A–S1C）。尽管转导的 PC 数量在不同分叶间有变化，推测是由于病毒扩散的局部差异，但整体转导在小脑皮层中广泛存在（图 S1D）。形态分析显示，在 Dab1fl/fl 小鼠中，整体小脑结构大体正常，但 VI 和 VII 分叶之间的上后裂隙（spf）选择性地且明显变浅，在某些情况下甚至缺失（图 S1D 和 S1E）。Calbindin 免疫染色显示，Dab1+/fl 对照中的 PC 形成连续单层，而 Dab1fl/fl 小鼠中的 PC 表现出层状破坏和 IGL 内的异位 PC（图 S1F）。PC 无序的程度在不同分叶间变化，在 VI/VII 和 X 分叶中最显著（图 S1G）。为了确定这些异常是否 specifically 源于 PC 中 Dab1 的缺失，我们随后构建了一种在 PC 特异性 L7 启动子下表达 EGFP 和 Cre 的 AAV（AAV-L7-EGFP-P2A-Cre），并在 P1 将其注射到 Dab1 flox 小鼠中。几乎所有 EGFP 阳性细胞都是 Calbindin 阳性的 PC，确认了细胞类型特异性（图 1A）。立体显微镜观察显示整体小脑结构看似完整，而 Dab1fl/fl 小鼠中的 spf 不清楚（图 1B）。形态和定量分析显示，主要裂隙如主裂隙（pf）和次裂隙（sf）未受影响，而 Dab1fl/fl 小鼠中的 spf 明显减少或几乎缺失（图 1C–1H）。Calbindin 免疫染色显示，在对照小鼠中，PC 形成连续单层，而在 Dab1fl/fl 小鼠中，PCL 被破坏，异位 PC 嵌入 IGL 内（图 1E 和 1I，箭头）。PC 无序的严重程度在不同分叶间变化，在 VI/VII 和 X 分叶中最明显（图 1I 和 1J）。与成功到达对照小鼠 PCL 的 PC 相比，Dab1fl/fl 小鼠中的异位 PC 树突发育明显不良（图 1K (a), (b)）。相反，在 Dab1fl/fl 小鼠中到达推定 IGL 上方（PC 自然存在的位置）的 PC 表现出与对照相似的成熟形态（图 1K (c), (d)）。图 1 PC 中出生后 DAB1 的缺失破坏 PC 层组织并选择性损害上后裂隙的形成显示完整标题图形查看器(A) 来自 Dab1+/fl 小鼠的小脑矢状切片，免疫染色显示 EGFP（绿色）和 Calbindin（红色），DAPI（洋红色）。(B) 小脑的立体显微镜图像。上后裂隙（spf）由箭头指示。(C–E) 小脑蚓部的矢状切片。(C) 主裂隙（pf）、次裂隙（sf）和 spf 分别由箭头和箭头指示。(D) EGFP 信号。(E) Calbindin 免疫染色（白色）；VI/VII 和 X 分叶中破坏的浦肯野细胞（PC）层组织由红色箭头指示。(F–H) Dab1+/fl 和 Dab1fl/fl 小鼠中 pf、sf 和 spf 裂隙深度的定量分析。(I) III、VI/VII、IX 和 X 分叶的高倍放大图像，显示 Dab1fl/fl 小鼠中的 PC 层破坏（红色箭头）。(J) 小叶表面 EGFP 阳性 PC 与分子层（ML）之间距离的定量分析。(K) 分叶的高倍放大 EGFP 图像。(L) 小脑的立体显微镜图像。(M) 蚓部矢状切片，显示 spf（箭头）。Dab1fl/fl 中的箭头指示异位 PC。(N–P) pf、sf 和 spf 裂隙深度的定量分析。(Q) 分叶的高倍放大图像，显示 Dab1fl/fl 小鼠中的 PC 层破坏（箭头）。(R) 小叶表面 EGFP 阳性 PC 与 ML 之间距离的定量分析。Dab1 flox 小鼠在出生后第 1 天（P1）注射 AAV-L7-EGFP-P2A-Cre 病毒，小脑在 P8（A–K）或 P15（L–R）进行分析。比例尺，20 μm（A 和 K），100 μm（I），500 μm（C–E 和 M），以及 200 μm（Q）。数据以均值 ± 标准差显示。每个基因型在 P8 和 P15 均为 n = 6–9 只小鼠，除 Dab1fl/fl 小鼠 P8 pf 深度定量（n = 5）外。裂隙深度在中线矢状切片上测量；对于 spf，每只动物分析四个切片，并使用最大深度进行定量（详见 STAR 方法）。统计显著性使用非配对双尾 t 检验评估（F–H 和 N–P）。跨分叶的 EGFP 阳性 PC–ML 距离使用双因素方差分析配合 Sidák 多重比较检验进行分析（J 和 R）。EGL，外部颗粒层；PCL，浦肯野细胞层；ML，分子层；IGL，内部颗粒层。在 PC 特异性敲除（KO）中观察到的表型与 CAG-Cre 介导的 Dab1 删除中看到的相同，确认局部叶状形成和层状的缺陷源于 PC 特异性 Dab1 的缺失。为了评估这些局部效应是否在后期阶段持续存在，在 P1 注射的 Dab1 cKO 小鼠在 P15 进行分析。Dab1fl/fl 小脑中的 spf 深度选择性减少，而其他裂隙未受影响（图 1L–1P）。再次观察到异常的 PC 定位，并且在 P8 时一样，局限于 VI/VII 和 X 分叶（图 1M, 1Q 和 1R）。异位 PC 保持不成熟，而 Dab1fl/fl 小鼠中到达表面附近的 PC 发育出与对照相当的树突（图 1Q），表明 PC 成熟是由到达推定 PCL 位置本身触发的，且 DAB1 可能不直接调节内在成熟程序。总之，这些结果表明 PC 中出生后的 DAB1 是适当、分叶特异性 PC 定位和相应裂隙发育所必需的。DAB1 仅在 PC 到达推定 PCL 位置之前是必需的接下来我们探讨了为什么出生后 Dab1 的缺失专门在 VI/VII 和 X 分叶中引起明显的 PC 无序。因为已知 PC 迁移动力学在不同分叶间变化，我们假设区域特异性迁移模式可能是这种选择性破坏的基础。为了探索这一点，我们检查了野生型小脑中 PC 随发育时间的迁移行为。在大多数分叶中——以 IX 分叶为例——所有 PC 在 P1–P2 时已到达推定 PCL 位置并形成连续单层（图 2A, 2A′, 2B 和 2B′）。相反，在 VI/VII 和 X 分叶中，PC 在 P1-P2 时保持多层状态，直到 P4 左右才到达推定 PCL 形成单层（图 2A–2C 和 2A′–2C′）。

这些观察结果表明，PC 中的 DAB1 对其迁移是必需的，直到 PC 到达推测的 PCL 位置。由于在 AAV 注射时，大多数小叶（如小叶 III 和 IX）中的 PC 已经到达推测的 PCL，因此这些小叶中的 PC 在很大程度上不会受到 Dab1 缺失的影响。

图 2 PC 到达推测的 PCL 位置在不同小叶间存在差异，且在 PC 单层形成后删除 Dab1 不影响 PC 位置或叶化
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(A–C) 野生型小鼠 P1 (A)、P2 (B) 和 P4 (C) 的矢状小脑切片，针对钙结合蛋白（白色或绿色）进行免疫染色，并以 DAPI（洋红色）复染。白色箭头 (A 和 B) 指示多层 PC。(A′–C′) 显示小叶 VI/VII、IX 和 X 的高倍放大视图。(D–I) 在 P4 向 Dab1 flox 小鼠注射 AAV-L7-EGFP-P2A-Cre 病毒，并在 P10 分析小脑。(D 和 E) 显示小叶 VI/VII (D) 和 X (E) 的矢状小脑切片。EGFP 显示为绿色，钙结合蛋白显示为白色。箭头 (D) 指示 spf。(F 和 G) 定量分析 Dab1+/fl 和 Dab1fl/fl 中叶片表面的 EGFP 阳性 PC 与 ML 之间的距离。(H) 小脑的立体显微镜图像。后上裂 (spf) 由箭头指示。(I) 定量分析 Dab1+/fl 和 Dab1fl/fl 中 spf 的深度。比例尺，200 μm (A–C)，20 μm (A′–C′)，和 100 μm (D 和 E)。PC-ML 距离数据显示为均值 ± 标准差 (F 和 G)，spf 深度显示为中位数及四分位距 (I)。每个基因型 n = 7–9 只小鼠。使用非配对双尾 t 检验评估 PC-ML 距离的统计学显著性 (F 和 G)，使用 Mann-Whitney U 检验评估裂深度的统计学显著性 (I)。PCP，浦肯野细胞板。

为了验证这一假设，我们在 P4 向 Dab1 flox 小鼠注射了 AAV-L7-EGFP-P2A-Cre，此时几乎所有的 PC 都已经到达近表面位置并形成单层。正如预期的那样，在小叶 VI/VII 和 X 中，或任何小叶中，很少观察到异常的 PC 定位 (图 2D–2G)。spf 也正常发育 (图 2D 和 H)，Dab1fl/fl 和 Dab1+/fl 同胞之间深度无显著差异 (图 2I)。这些结果支持了 DAB1 仅在单层形成前是 PC 迁移所必需的假设，并表明一旦 PC 正确形成单层，即使在缺乏 DAB1 的情况下，正常的叶化也可以进行。结合图 1 实验的发现——即叶化缺陷仅发生在 Dab1 缺陷 PC 未能到达推测的 PCL 位置的小叶 VI/VII 中，而包含 Dab1 缺陷 PC 但仍到达推测的 PCL 位置的区域形成正常的裂（例如 pf 和 sf）——这些结果表明，DAB1 通过建立正确的 PC 定位来促进叶化，而不是通过指导 PC 内在发育程序。

PC 从推测的 PCL 位置即使轻微移位也会损害局部 GCP 增殖
为了调查为什么受损的 PC 迁移会导致局部叶化缺陷，我们考虑了局部 GCP 增殖可能受到影响的可能性。确实，Smeyne 等人使用 L7-CD 毒素转基因小鼠表明，缺乏 PC 的区域表现出较薄的 EGL，而保留 PC 的区域显示较厚的 EGL，表明 PC 的存在支持 GCP 扩张。然而，PC 相对于软脑膜表面的位置是否调节局部 GCP 增殖一直不清楚。为了解决这个问题，我们检查了 reeler (rl?/?) 小鼠的小脑切片。在 P7 的 rl ± 小鼠中，PC 对齐在皮质表面附近（就在 IGL 上方），并且 EGL 在所有小叶中显得均匀厚实 (图 3A)。相比之下，在 rl?/? 小鼠中，大多数 PC 仍位于深处，而一小部分已经到达皮质表面附近 (图 3B 中箭头)。特别地，在包含表面 PC 的区域中，EGL 明显比 PC 仍位于较深位置的区域更厚 (图 3C–3E)。与这些观察结果一致，定量分析显示，在 rl?/? 小鼠中，在 PC 已到达皮质表面附近的区域，EGL 及其 Ki67+ 外层增殖区（外层 EGL）显著比缺乏表面 PC 的区域更厚，PC 丰富区域的厚度与 rl ± 小鼠中的厚度相当 (图 3F 和 3G)。这些发现表明，PC 的异常定位可能导致 GCP 增殖受损。因此，我们假设 GCP 增殖减少可能是 Dab1 cKO 小鼠中观察到的局部叶化缺陷的基础。

图 3 PC 从 PCL 移位损害 reeler 和 Dab1 cKO 小脑中的颗粒细胞前体增殖
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(A 和 B) P7 时 rl+/? (A) 和 rl?/? (B) 小鼠的矢状小脑切片，针对钙结合蛋白（绿色）进行免疫染色，并以 DAPI（洋红色）复染。单独显示钙结合蛋白信号（白色）。rl?/? 小鼠 (B) 中的箭头指示一小部分已到达推测的 PCL 位置的 PC。(C–E) A 和 B 中指示的框区的高倍放大视图，针对钙结合蛋白（绿色）和 Ki67（红色）进行免疫染色，并以 DAPI（蓝色）复染。外层 EGL 由双头箭头指示。(F 和 G) 定量分析总 EGL 厚度 (F) 和外层 EGL 厚度 (G)，比较 rl± 区域 (如 C 所示)、包含已到达推测的 PCL 位置的 PC 的 rl?/? 区域 (D) 和缺乏已到达推测的 PCL 位置的 PC 的 rl?/? 区域 (E)。在 150-μm 宽的片段内包含三个或更多已到达推测的 PCL 位置的 PC 的区域被归类为 D 组，而包含一个或更少此类细胞的区域被归类为 E 组。(H–K) 在 P1 向 Dab1 flox 小鼠注射 AAV-L7-EGFP-P2A-Cre 病毒，并在注射 BrdU 后 1 小时的 P5 分析小脑。(H) 矢状小脑切片，针对 EGFP（绿色）和钙结合蛋白（白色）进行免疫染色，并以 DAPI（洋红色）复染。箭头指示 Dab1fl/fl 小鼠中 PC 排列紊乱。(I) 小叶 VI/VII 的高倍放大视图。箭头指示 IGL 中异位定位的 PC。(J) 针对 EGL 中的 BrdU（红色）进行免疫染色，并以 DAPI（蓝色）复染。(K) 定量分析 EGL 中 BrdU 阳性细胞与 DAPI 阳性细胞的比例。比例尺，500 μm (A, B, 和 H)，100 μm (C–E)，和 50 μm (I 和 J)。数据显示为均值 ± 标准差。样本量如下：reeler 小鼠，rl+/? (n = 6) 和 rl?/? (n = 5)；Dab1 flox 小鼠，Dab1+/fl (n = 7) 和 Dab1fl/fl (n = 6)。对于 EGL 厚度 (F 和 G)，每只动物测量单个切片内的三个点并取平均值。对于 BrdU/DAPI 定量 (K)，每只动物分析一个切片，并在 EGL 外层 150 μm 内计数细胞。使用单向方差分析 (ANOVA) 随后 Tukey 多重比较检验评估 reeler 小鼠 EGL 厚度 (F 和 G) 的统计学显著性，使用非配对双尾 t 检验评估 BrdU+/DAPI+ 细胞 (K) 的统计学显著性。

为了验证这种可能性，我们使用 5-溴 -2'-脱氧尿苷 (BrdU) 脉冲标记，评估了 Dab1 cKO 小鼠在 P5（叶化缺陷前的阶段）的 GCP 增殖。注射了 AAV-CAG-EGFP-P2A-Cre，并在 P5 给予 BrdU 后 1 小时固定小脑。与图 1 所示结果一致，在小叶 VI/VII 中观察到 IGL 中异常的 PC 定位 (图 3H 和 3I)。对小叶 VI/VII EGL 中 BrdU+/DAPI+ 细胞的定量分析显示，与 Dab1 +/fl 对照相比，Dab1 fl/fl 小鼠中显著减少 (图 3J 和 3K)，这表明 PC 从其正常位置即使轻微移位也可能损害局部 GCP 增殖。

SHH 补充恢复由 PC 迁移受损引起的叶化缺陷
由于已知 PC 衍生的 SHH 促进 GCP 增殖，我们推测 Dab1 fl/fl 小鼠中含异位 PC 区域中 GCP 增殖减少归因于供给 EGL 的 SHH 减少。为了测试 SHH 补充是否能恢复小叶 VI/VII 的叶化，我们通过向 Dab1 flox 小鼠共注射 AAV-L7-EGFP-P2A-Cre ("AAV (L7)") 和 AAV-CAG-DIO-Shh ("AAV (Shh)") 在 PC 中特异性表达 SHH。我们首先检查了在正常条件下 PC 中强制表达 SHH 是否影响小脑形态。为此，在 P1 向 Dab1 +/fl 小鼠注射 AAV (L7) 或 AAV (L7) 和 AAV (Shh) 的组合，并在 P8 收集小脑 (图 S2A)。免疫染色确认了一部分 EGFP 阳性 PC 中强烈的 SHH 免疫反应性，而两组中的 PC 都维持了正常的单层排列 (图 S2B)。这些小脑的整体架构——包括 pf、sf 和 spf——在这些组之间无法区分 (图 S2A–S2F)。这些结果表明，该系统实现的 SHH 表达水平在生理上是合适的。然后我们调查了 SHH 补充是否能恢复 Dab1 cKO 中的叶化缺陷。分析了三个实验组：注射 AAV (L7) 的 Dab1+/fl 小鼠 (Ctrl)，注射 AAV (L7) 的 Dab1fl/fl 小鼠 (KO)，以及共注射 AAV (L7) 和 AAV (Shh) 的 Dab1fl/fl 小鼠 (KO + rescue)。与以前的实验一样，在 KO 和 KO + rescue 小鼠的小叶 VI/VII 中都观察到异常的 PC 定位，且移位程度相同 (图 4A 和 4B)。此外，我们没有观察到 KO 和 KO + rescue 小鼠之间 PC 形态的明显差异。然而值得注意的是，救援组中的 spf 恢复到了与 Dab1 +/fl 对照相当的深度 (图 4C 和 4D)。这些结果表明，在不影响对照小脑叶化的剂量下补充 SHH 可以补偿由 PC 迁移受损引起的局部叶化缺陷。此外，尽管 PC 错位，恢复的裂发生在与 Dab1+/fl 对照相同的位置，这表明精确的 PC 定位并不决定裂的位置，尽管正常的 PC 定位是足够 SHH 输送到 GCP 所必需的。

图 4 尽管 PC 持续错位，SHH 表达仍救援小脑叶化缺陷
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(A) 针对 EGFP（绿色）和钙结合蛋白（白色）进行免疫染色，并以 DAPI（洋红色）复染的矢状小脑切片。箭头指示 spf。在钙结合蛋白图像中，箭头标记 PC 层破坏。(B) 定量分析叶片表面的 EGFP 阳性 PC 与 ML 之间的距离。(C) 小叶 VI/VII 的高倍放大视图，针对 EGFP（绿色）、SHH（白色）和钙结合蛋白（青色）进行免疫染色，并以 DAPI（洋红色）复染。箭头指示 spf。(D) 定量分析 spf 深度。Dab1 flox 小鼠在 P1 注射 AAV，小脑在 P8 分析。显示了三个实验组：(Dab1+/fl L7) 注射 AAV-L7-EGFP-P2A-Cre 的 Dab1+/fl 小鼠（对照）；(Dab1fl/fl L7) 注射 AAV-L7-EGFP-P2A-Cre 的 Dab1fl/fl 小鼠 (Dab1 cKO)；以及 (Dab1fl/fl L7 &SHH) 注射 AAV-L7-EGFP-P2A-Cre 和 AAV-CAG-DIO-SHH 的 Dab1fl/fl 小鼠 (Dab1 cKO 和 SHH 表达)。比例尺，500 μm (A) 和 200 μm (C)。数据显示为均值 ± 标准差。每组 n = 4–6 只小鼠。对于 spf 的裂长度，每只动物分析四个切片，并使用最大深度进行定量。使用单向方差分析 (ANOVA) 随后 Tukey 多重比较检验评估统计学显著性 (B 和 D)。

PC 定位，而非 SHH 产生，决定 SHH 输送
我们目前的发现表明，PC 必须到达推测的 PCL 位置才能充分将 SHH 输送到 EGL。我们接下来探究含异位 PC 区域中受损的 SHH 信号是否反映了 SHH 产生本身的减少，或者 SHH 是否正常产生但未能到达 EGL。P5 时 Dab1 flox 小脑中的 SHH 免疫染色揭示了 Dab1+/fl 小鼠中定位正确的 PC 与 Dab1fl/fl 小鼠 IGL 内异位 PC 之间相当的信号强度 (图 5A)，定量分析证实了这一点 (图 5C)。P7 时 reeler 小脑中的类似比较显示，rl ± 小鼠中的表面 PC 与 rl?/? 小鼠中深部定位的 PC 之间 SHH 蛋白水平无显著差异 (图 5B 和 5D)。此外，reeler 小鼠中的原位杂交显示基因型之间 Shh mRNA 表达无明显差异 (图 5E)。

图 5 PC 错位不改变 SHH 产生但减少 EGL 中的 SHH 信号
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(A 和 B) 在 P1 注射 AAV-CAG-EGFP-P2A-Cre 病毒并在 P5 分析 (小叶 VI/VII) (A) 的 Dab1 flox 小鼠的矢状小脑切片，以及 P7 时杂合型和纯合型 reeler 小鼠的切片 (B)，针对钙结合蛋白（绿色）和 SHH（白色）进行免疫染色，并以 DAPI（洋红色）复染。异位 PC 由红色箭头指示 (A)。比较 rl± 小鼠中推测的 PCL 位置的 PC 与 rl?/? 小鼠中深部定位的 PC (B)。(C 和 D) 分别对应于 (A) 和 (B) 的单个 PC 中归一化到钙结合蛋白的 SHH 荧光定量。

数值以任意单位（a.u.）显示。(E) P7 期 Reeler 小鼠小脑矢状切片的 Shh 原位杂交。Shh 转录本显示为黄色，DAPI 显示为蓝色。(F) P7 期 Reeler 小鼠小脑裂解液中 SHH 和 Calbindin 的 Western 印迹分析。(G) 在 rl± 和 rl?/? 小鼠中定量 SHH/Calbindin 信号比率。(H–K) E17 期 Reeler 小鼠小脑矢状切片。(H) 针对 RORα（白色）进行免疫染色的切片，DAPI 显示为品红色。(I) (H) 中框选区域的更高放大倍数视图。(J) 前叶切片针对 SHH（白色）进行免疫染色，DAPI 显示为品红色。EGL 和 PCs 之间的距离由双头箭头表示（I 和 J）。(K) 前叶 EGL 中 Gli1 的原位杂交。Gli1 转录本显示为黄色，DAPI 显示为蓝色。比例尺，20 μm (A, B, E 和 I–K) 和 200 μm (H)。数据显示为均值 ± 标准差。Dab1+/fl (n = 4) 和 Dab1fl/fl (n = 5) (C)，n = 5 (rl+/?) 和 4 (rl?/?) (D)，以及 n = 10 (rl+/?) 和 8 (rl?/?) 小鼠 (G)。对于 SHH/Calbindin 比率 (C 和 D)，每只动物分析三个切片，每个切片定量三个 PC。统计学显著性使用非配对双尾 t 检验评估 (C, D 和 G)。PCP，浦肯野细胞板。

由于 PC 是小脑中 SHH 的唯一来源，小脑裂解液中检测到的蛋白质水平反映了 PC 中的 SHH 产生。对 P7 期 rl ± 和 rl?/? 小鼠小脑裂解液进行 Western 印迹分析显示，两种基因型之间的 SHH 前体（45 kDa）水平相当（图 5F）。对 SHH 条带强度进行定量，并以 Calbindin 归一化，证实两种基因型之间的 SHH 水平无显著差异（图 5G）。这些发现表明 SHH 表达是细胞内在的，独立于 Reelin 信号传导和 PC 的位置状态。

为了进一步评估 PC 位置对 EGL 中 SHH 信号传导的影响，我们分析了胚胎期的 Reeler 小脑，其中 PC 的位置可以明显区别于正常小鼠。使用抗 RORα 抗体可视化 PC 位置，该抗体在胚胎期主要标记 PC。在 E15 时，PC 位置已在基因型之间显示出差异，rl± 小鼠中的一些 PC 开始形成多层 PCP（图 S3）。到 E17 时，rl ± 小鼠中的 PC 已进一步向皮层表面移动并形成清晰的 PCP，而 rl?/? 小鼠中的 PC 仍位于深层（图 5H 和 5I）。与我们的出生后分析一致，rl ± 小鼠中位于表面的 PC 与 rl?/? 小鼠中位于深层的 PC 之间的 SHH 免疫反应性相似（图 5J）。然而，反映 GCP 中 SHH 通路活性的 EGL 中 Gli1 表达显示出明显的对比：在 rl ± 小鼠中，表面 PC 上方区域的 Gli1 信号强烈，而 rl?/? 小鼠中位于深层 PC 上方的 EGL 表现出显著降低的 Gli1 信号（图 5K）。综上所述，这些发现表明 PC 的空间位置——特别是它们与 EGL 的邻近程度或它们在假定 PCL 中的适当定位——作为 EGL 中 SHH 递送和下游信号传导的关键决定因素，即使 SHH 产生保持不变。

GCP 增殖的晚期高峰与 spf 形成的延迟相吻合

我们接下来关注 spf，这是在 Dab1 cKO 小鼠中选择性丢失的裂（图 1）。对野生型小脑（C57BL/6N）在出生后各阶段的检查显示，大多数裂在 P2 时已形成，而 spf 仅在 P7–8 左右出现（图 6A–6D）。这种发育时间上的差异促使我们检查 GCP 增殖时间是否在叶 VI/VII 与其他叶之间存在差异。为此，我们在野生型小鼠的 P2、P4、P6 和 P8 时给予 BrdU，1 小时后固定小脑，并定量 EGL 中的 BrdU+ 细胞。在叶 III 和 IX 中，BrdU+ 细胞从 P2 到 P6 适度增加，并在 P8 时下降。相比之下，叶 VI/VII 在 P6 时显示出 BrdU+ 细胞明显激增，随后在 P8 时持续增加（图 6E 和 6F）。BrdU+/DAPI+ 比例表现出相似的趋势：叶 III 和 IX 在 P8 时显示下降，而叶 VI/VII 保持高度增殖活性（图 6G）。EGL 厚度遵循相同的模式，在叶 VI/VII 中稳步增加，而在其他叶中较早达到峰值（图 6H）。这些区域特异性的动态变化与 Legue 等人早期的工作一致，他们使用不同的小鼠品系证明了叶 VI/VII 中 GCP 增殖的类似晚期高峰。

图 6 GCP 增殖的时间高峰在叶 VI/VII 中发生较晚
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(A–D) 野生型小鼠在 P2、4、6 和 8 时的小脑矢状切片。后上裂（spf）由箭头指示 (D)。(E–H) 野生型小脑在 P2、4、6 或 8 注射 BrdU 后 1 小时固定。(E) 叶 III、VI/VII 和 IX 中 EGL 的免疫染色，显示 DAPI（蓝色）和 BrdU（红色）。(F 和 G) 在每个发育阶段，叶 III、VI/VII 和 IX 中 EGL 外 150 μm 范围内 BrdU 阳性细胞数量 (F) 和 BrdU 阳性细胞与 DAPI 阳性细胞比率 (G) 的定量。(H) 在每个发育阶段，指示叶中 EGL 厚度的定量。比例尺，200 μm (A–D) 和 20 μm (E)。数据显示为均值 ± 标准差。样本量如下：n = 6 (P2)、n = 6 (P4)、n = 5 (P6) 和 n = 6 (P8) 小鼠。对于 EGL 厚度 (H)，对单个切片内的三个点进行测量，每只动物取平均值。对于 BrdU/DAPI 定量 (F 和 G)，每只动物分析一个切片，并在 EGL 外 150 μm 范围内计数细胞。统计分析使用双因素方差分析后进行 Tukey 多重比较检验，比较每个发育阶段内的叶。

综上所述，这些观察表明叶 VI/VII 表现出 GCP 增殖独特的晚期上升，这与 spf 的晚期形成相对应。值得注意的是，这个较晚的增殖高峰与早期图表中揭示的两个特征一致：叶 VI/VII 中的 PC 比其他叶中的 PC 更晚到达假定 PCL 位置（图 2），且 PC 必须到达 PCL 位置才能有效递送 SHH 并驱动 GCP 增殖（图 3、4 和 5）。整合这些发现，我们提出 PC 到达假定 PCL 位置的时间可能有助于决定 GCP 增殖何时增强，进而决定单个裂何时形成。

PC 迁移的局部延迟导致胚胎发育过程中区域特异性叶状缺陷

为了测试所提出的模型——即 PC 到达皮层表面附近（位于 IGL 正上方的假定 PCL 位置）的时间主要决定裂形成的时间——是否广泛适用于小脑叶状形成，包括胚胎期出现的裂，我们尝试在胚胎发生期间选择性干扰 PC 迁移。为了实现这一目标，我们在 E15 时将 AAV-L7-EGFP-P2A-Cre 注射到 Dab1 flox 胚胎中，并在 P0 时检查小脑。在 PC 的一个子集簇中检测到 EGFP 表达（图 7A），这反映了 L7 启动子在胚胎期仅在一部分 PC 簇中活跃。我们发现，沿着小脑蚓部的中线，一簇 EGFP 阳性 PC 持续出现在未来包含次级裂的中心后叶的受限区域中（图 7A）。聚焦于该部位，Dab1fl/fl 小鼠中的 EGFP 阳性（Dab1 缺陷）PC 未能到达靠近皮层表面的位置，而 Dab1 fl/fl 小鼠中邻近的 EGFP 阴性 PC 和 Dab1 +/fl 小鼠中的 EGFP 阳性 PC 迁移到了靠近皮层表面的假定 PCL 位置（图 7A-7C），表明 Dab1 也是胚胎期 PC 迁移所必需的。值得注意的是，次级裂在 Dab1+/fl 小鼠中已经开始形成，但在 Dab1 fl/fl 小鼠中受到显著损害，而缺乏 EGFP 阳性 PC 的初级裂在两种基因型中均正常形成（图 7D 和 7E）。因此，PC 迁移延迟部位的叶状形成受到选择性损害。这些结果共同支持所提出的模型，即 PC 到达假定 PCL 位置的时间在局部有助于决定局部叶状模式。

图 7 胚胎期 Dab1 缺失导致区域特异性 PC 错位和局部叶状缺陷
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(A) 针对 EGFP（绿色）和 Calbindin（白色）进行免疫染色的小脑矢状切片，DAPI 显示为品红色。次级裂（sf）由箭头指示。(B) (A) Calbindin/GFP 图像中垂直线指示区域的更高放大倍数视图，显示 DAPI（蓝色）、EGFP（绿色）和 Calbindin（红色）。箭头指示未到达假定 PCL 位置的异位 PC。(C) 定量 Dab1+/fl 和 Dab1fl/fl 小鼠中叶表面的 EGFP 阳性 PC 与 ML 之间的距离。(D 和 E) 初级裂 (pf) 和 sf 裂深度的定量。Dab1 flox 小鼠在 E15 时注射 AAV-L7-EGFP-P2A-Cre 病毒，并在 P0 时分析小脑。比例尺，200 μm (A) 和 20 μm (B)。PC–ML 距离数据显示为均值 ± 标准差 (C)，裂深度数据显示为中位数及四分位距 (D 和 E)。n = 6 (Dab1+/fl) 和 5 (Dab1fl/fl) 小鼠。使用非配对双尾 t 检验评估 PC–ML 距离 (C) 的统计学显著性，使用 Mann-Whitney U 检验评估裂深度 (D 和 E)。pc，前前裂。

讨论

在本研究中，我们证明了 PC 迁移到假定 PCL 位置的时间是通过局部向 GCP 递送 SHH 来决定小脑叶状形成的主要因素。此外，我们表明 PC 到达假定 PCL 位置的时间在空间上的差异为小脑叶状形成时间顺序的长期谜团提供了生物学解释。重要的是，我们在 P1 期进行的 Dab1 cKO——在 PC 单层和多层区域共存的发育窗口期进行——揭示了 PC 到达时间的区域差异，从而揭示出单层尚未形成区域的特异性叶状缺陷。这种方法还揭示出 DAB1 仅在 PC 到达假定 PCL 位置之前的 PC 迁移过程中是必需的，此后则是可替代的。PC 未能到达假定 PCL 位置会减少局部依赖 SHH 的 GCP 扩增，并选择性破坏裂形成。即使 PC 持续错位，恢复 SHH 也能挽救这种缺陷的叶状形成。基于这些发现，我们提出以下小脑叶状形成模型：在 E17 左右的胚胎期，PC 向皮层表面分散并形成多层，其中最上层的 PC 已到达假定 PCL 位置并开始向 EGL 中覆盖的 GCP 递送 SHH，从而启动主要裂的形成。出生后，大多数叶迅速完成单层形成，而叶 VI/VII 包含的 PC 簇到达时间明显较晚，在 P4 左右到达 PCL。这种时间滞后导致与其他叶相比 GCP 增殖的时间高峰发生偏移，从而产生出生后发生的较晚叶状形成。

尽管 PC 定位异常和小脑叶状形成缺陷在 reeler、yotari 和 cdf 等经典突变体中长期已知共存，但这两种表型之间的机制联系尚未得到测试。在这里，我们表明，即使 PC 偏离 PCL 的程度很小——远不如 reeler 和 yotari 中观察到的严重——也会限制到达 GCP 的 SHH 量并导致局部叶状缺陷。这些发现将 PC 单层的形成定义为有效递送 SHH 所必需的具体位置条件，进而也是小脑叶状形成所必需的。

几种机制可能解释 PC 到达假定 PCL 位置如何增加到达 GCP 的 SHH 量。最直接的解释是 PC 和 GCP 之间距离的缩短。当 PC 到达假定 PCL 时，它们的位置更接近 EGL，可能促进 SHH 递送。相比之下，在 Dab1 cKO 小鼠的叶 VI/VII 中，这一距离仍然较大。然而，在这个模型中，PC 从假定 PCL 位移的距离很短（< 50 μm），这表明仅距离本身不太可能完全解释观察到的依赖 SHH 的 GCP 增殖减少。因此，由 PC 到达假定 PCL 触发的其他机制也可能起作用。向 EGL 延伸的 PC 树突可能进一步促进 SHH 递送。

当浦肯野细胞（PCs）到达推测的浦肯野细胞层（PCL）位置时，它们会经历树突成熟（图 1K 和 1Q），这与之前的观察一致，且 SHH 免疫反应性延伸至整个树突树（图 5B），如先前报道。鉴于 SHH 是一种脂质修饰的配体，在释放前保持膜结合状态，树突膜面积的显著增加预计会扩大 SHH 可被递送至上方外部颗粒层（EGL）的总表面积。此外，随着 PC 树突延伸，从这些树突释放的 SHH 从接近颗粒细胞祖细胞（GCPs）的部位递送，穿过的细胞外距离极小。相比之下，当 PCs 在 Dab1 cKO 小鼠中未能到达 PCL 位置时，SHH 必须穿过内部颗粒层（IGL）和分子层（ML）才能到达 EGL。在此过程中，SHH 可能会受到扩散限制或降解。PCs 树突成熟增强 SHH 递送的这一观点与 Bdnf 敲除小鼠中观察到的表型一致，在该小鼠中，PC 成熟受损与皱褶形成缺陷共存。在这个模型中，顶后裂隙（spf）缺失，而其他在树突出现之前的胚胎阶段开始形成的主要裂隙变得较浅。这表明 PC 树突成熟增强了这些主要裂隙中皱褶的深度，且 PC 树突成熟介导的 GCP 增殖是小脑皱褶形成的一般机制。

我们进一步细化了 DAB1 在小脑发育过程中的作用。尽管对 yotari 突变体的分析表明 DAB1 至少是 PC 扩散初始步骤所必需的，但 DAB1 在 PC 迁移过程中需要持续多长时间仍不清楚。我们的发现通过证明 DAB1 仅在 PCs 到达推测的 PCL 位置之前是必需的，此后则不再需要，从而加深了对此的理解。此外，我们表明 DAB1 在皱褶形成中的作用是通过建立正确的 PC 定位介导的，而不是通过指导 PC 内在程序。这些见解细化了对 yotari 和 reeler 小鼠中小脑皱褶形成缺陷的机制解释——这些情况反映了人类中 Reelin 相关的小脑皱褶形成缺陷——通过表明 PC 迁移失败是主要缺陷，而由于 PC-GCP 距离显著增加导致 SHH 向 GCPs 的递送减少，从而损害皱褶形成作为次要后果。

我们的研究结果表明，DAB1 是 PC 从多层组织向单层组织过渡所必需的。尽管关于 PCs 是否使用伯格曼胶质细胞（BG）纤维作为迁移支架仍存在争议，静态组织学分析表明 PCs 沿向脑膜表面延伸的 BG 纤维迁移。此外，包括 Tenascin-C 在内的细胞外基质分子在此期间的 PC 周围存在。鉴于 Reelin 信号在控制神经元与细胞外环境（包括胶质支架和细胞外基质）之间相互作用中的已知功能，PCs 与细胞外因子之间的相互作用可能受 Reelin 信号调控。或者，Reelin 信号可能以细胞自主的方式控制 PC 迁移。确实，在 PC 迁移的早期阶段，报道了在小脑侧背侧区域 PCs 出现类似折返的运动，其中 PCs 似乎穿过 BG 纤维。由于细胞骨架的控制对 PC 迁移至关重要，且 Reelin 信号在多种情境下通过细胞骨架控制自主调节神经元迁移，Reelin 介导的细胞骨架控制可能有助于 PC 迁移。未来的研究需要澄清 PCs 如何解读 Reelin 信号以到达推测的 PCL 位置。

最后，我们的数据提供了一个机制框架，有助于解释小脑裂隙如何随时间顺序出现。先前的工作表明 VI/VII 小叶遵循发育延迟程序。VI/VII 小叶中的 Gli1 表达相对于其他小叶延迟。Legue 等人证明，GCP 产生的时间峰值和 EGL 增厚在 VI/VII 小叶中发生较晚，并推测这些延迟可能构成 spf 晚期形成的基础。我们的结果表明，PC 到达推测的 PCL 位置的时间充当了一个发育计时器，规定了依赖 SHH 的 GCP 扩张何时启动，从而控制裂隙形成的时间顺序。通过选择性干扰 PC 定位并恢复 SHH 信号，我们的实验提供了将 PC 到达时间与皱褶形成的时间顺序联系起来的直接机制证据。

需要注意的是，我们提出的 PC 迁移-SHH 递送 - 皱褶形成轴并不意味着 PCs 指示裂隙将在何处形成。尽管在皱褶形成之前，未来的裂隙处 EGL 向内增厚，但未观察到 PCs 在这些部位更早到达，我们在分析中也未检测到任何更早的 PC 到达。此外，相对于周围区域，未来裂隙处的 GCP 增殖并没有升高。相反，在我们的模型中，PCs 通过其迁移的集体动力学影响皱褶形成。PCs 以簇的形式迁移，VI/VII 小叶中较晚观察到的单层形成可能反映了簇到达推测的 PCL 位置的延迟。这种延迟共同推迟了 SHH 向 GCPs 的递送，转移了 GCP 扩张的时间峰值，从而驱动顺序皱褶形成。

尽管 VI/VII 小叶和 X 小叶中的 PCs 完成单层形成的时间都晚于其他小叶，但只有 VI/VII 小叶产生额外的裂隙。值得注意的是，X 小叶在 P2 时就已经表现出相对较厚的 EGL（图 6A），且相对于 VI/VII 小叶，其向 P6-P8 的 GCP 增殖增加不那么明显。因为 X 小叶更靠近脑室区，该区域的 PCs 在扩散期间移动的距离要短得多。因此，PC 到达推测的 PCL 位置之前和之后 SHH 可及性的差异可能不如 VI/VII 小叶中那么明显，后者是距离脑室区最远的。在 VI/VII 小叶中，PC 迁移的延迟很可能造成依赖 SHH 的 GCP 扩张更大幅度的时间转移。在 Dab1 cKO 小鼠中，尽管 X 小叶中 PC 位置异常，但我们没有观察到对副绒球裂隙的明显影响（数据未显示）。这可能是因为，如上所述，对 X 小叶 GCP 增殖的影响相对轻微，且因为相邻 IX 小叶中的 PCs（可能有助于副绒球裂隙形成）可以到达 PCL 位置。

尽管 GCP 扩张的延迟峰值似乎是产生晚期形成裂隙的必要条件，但仅凭它可能并不充分。其他因素可能影响转移的增殖波最终是否产生折叠。Lawton 等人提出，锚定中心（ACs）——由 Sudarov 和 Joyner 在每个裂隙基部识别出的独特细胞结构——建立了机械稳定的边界，将小脑划分为能够进一步折叠的自相似结构域。在其框架内，VI/VII 小叶的独特形态可能提供一个允许的环境，在此环境中延迟的 GCP 扩张可能有助于 spf 的形成。

总之，我们的研究确立了 PC 迁移到推测的 PCL 位置是一个关键的发育事件，它使得 SHH 能有效递送至 GCPs，从而驱动小脑皱褶形成。PC 到达推测的 PCL 位置的时间在空间上的差异主要控制裂隙形成的时间顺序，为这一基本发育现象提供了机制解释。

研究的局限性

我们的分析主要侧重于小鼠小脑蚓部；因此，尚不清楚我们提出的 PC 迁移-SHH 递送 - 皱褶形成轴是否延伸至小鼠小脑半球的其他裂隙和人类小脑。未来的工作将需要测试这种机制在小脑不同区域和物种中的普遍性。

在本研究中，我们对 Dab1 cKO 小鼠的分析仅限于 P15，我们没有评估皱褶形成缺陷和异常 PC 定位是否在成年期持续存在。此外，鉴于 VI/VII 小叶发育不良与神经发育障碍（包括自闭症谱系障碍）相关，观察到的皱褶形成缺陷的长期后果仍然具有相当大的研究兴趣。未来的研究应评估与这些结构异常相关的运动和非运动功能。

资源可用性

主要联系人

更多信息以及资源和试剂的请求应发送给主要联系人 Kazunori Nakajima ([e-mail])，并由其履行。

材料可用性

本研究中生成的所有材料均可向主要联系人请求获取。

数据和代码可用性

* 本文中报告的数据将由主要联系人根据请求分享。
* 本研究未生成大规模数据集或自定义代码。
* 重新分析本文报告数据所需的任何额外信息均可向主要联系人请求获取。

致谢

我们感谢神户大学（日本神户）的 Hideaki Imai 博士和滋贺医科大学（日本大津）的 Yu Katsuyama 博士提供 Dab1 flox 小鼠，以及名古屋市立大学的 Mitsuharu Hattori 博士提供 ICR 背景的 reeler 小鼠。我们还要感谢 Howard Hughes 医学研究所的 Karel Svoboda 提供 pAAV-CAG-EGFP，宾夕法尼亚大学 Penn 载体核心提供 pAdΔF6 和 pAAV2/9，以及群马大学的 Hirokazu Hirai 博士提供 pAAV-L7-6-EGFP。本工作由 JST SPRING 项目支持 R.U.；JSPS KAKENHI grants 支持 Y.H. (JP20K06670, JP23H02491, JP24H01972)；T.H. (JP24K09668, JP21K06413)；K.N. (JP20H05688, JP25K02437)；朝日玻璃基金会支持 Y.H.；武田科学基金会支持 Y.H. 和 K.N.；庆应义塾福泽纪念教育研究推进基金支持 K.N.；庆应义塾学术发展基金支持 Y.H. 和 K.N.；AMED grant no. JP25gm6910028 支持 Y.H.

作者贡献

构想，R.U.，Y.H. 和 K.N.；方法，R.U.，T.H.，Y.H. 和 K.N.；调查，R.U.，T.H.，T.K.，Y.H. 和 K.N.；可视化，R.U.；指导，Y.H. 和 K.N.；写作 - 原稿，R.U.；写作 - 审阅和编辑，Y.H. 和 K.N.。R.U. 进行了大部分实验。T.H. 和 T.K. 使用 AAV-CAG-EGFP-P2A-Cre 病毒进行了 Dab1 cKO 小鼠的初步分析（图 S1）。

利益冲突声明

作者声明没有竞争利益。

生成式 AI 和 AI 辅助技术在写作过程中的声明

在准备本手稿期间，作者使用了 ChatGPT (OpenAI) 来协助语言润色。所有内容均由作者审阅和编辑，作者对最终出版承担全部责任。

STAR★方法

关键资源表

| 试剂或资源 | 来源 | 标识符 |
| :--- | :--- | :--- |
| **抗体** | | |
| Rabbit anti GFP | MBL | Cat#: 598; RRID: AB_591819 |
| Chicken anti GFP | abcam | Cat#: ab13970; RRID: AB_300798 |
| Goat anti Calbindin | Nittobo | Cat#: MFSR100400; RRID: AB_2571569 |
| Rabbit anti BLBP | Millipore | Cat#: ABN14; RRID: AB_10000325 |
| Chicken anti Nestin | Aves lab | Cat#: NES; RRID: AB_2314882 |
| Rabbit anti Ki67 | Thermo Fisher | Cat#: FM9-106-S1; RRID: AB_2341197 |
| Mouse anti BrdU | BD biosciences | Cat#: 347580; RRID: AB_400326 |
| Rabbit anti SHH | Santa Cruz | Cat#: sc9024; RRID: AB_2239216 |
| Rabbit anti RORα | Santa Cruz | Cat#: sc28612; RRID: AB_28612 |
| Mouse anti SHH | Santa Cruz | Cat#: sc365112; RRID: AB_10709580 |
| Rabbit anti Calbindin | Nittobo | Cat#: MFSR100390; RRID: AB_2571568 |
| Alexa Fluor 488 donkey anti-rabbit IgG | Invitrogen | Cat#: A21206; RRID: AB_2535792 |
| Alexa Fluor 488 donkey anti-chicken IgY | Jackson Immuno Research | Cat#: 703-545-155; RRID: AB_2340375 |
| Alexa Fluor 555 donkey anti-goat IgG | Invitrogen | Cat#: A21432; RRID: AB_141788 |
| Alexa Fluor 555 donkey anti-rabbit IgG | Invitrogen | Cat#: A31572; RRID: AB_162543 |
| Alexa Fluor 555 donkey anti-mouse IgG | Invitrogen | Cat#: A31570; RRID: AB_2536180 |
| Alexa Fluor 594 donkey anti-chicken IgY | Jackson Immuno Research | Cat#: 703-585-155; RRID: AB_2340377 |
| Alexa Fluor 647 donkey anti-goat IgG | Invitrogen | Cat#: A21447; RRID: AB_2535864 |
| HRP-conjugated goat anti-mouse IgG | Jackson Immuno Research | Cat#: 115-035-003; RRID: AB_10015289 |
| HRP-conjugated goat anti-rabbit IgG | Jackson Immuno Research | Cat#: 111-035-003; RRID: AB_2313567 |
| **细菌和病毒株系** | | |
| AAV-CAG-EGFP-P2A-Cre | 本文 | N/A |
| AAV-L7-EGFP-P2A-Cre | 本文 | N/A |
| AAV-CAG-DIO-SHH | 本文 | N/A |
| **化学品、多肽和重组蛋白** | | |
| AAV-MAX Helper-Free AAV Production System | Thermo Fisher Scientific | Cat#: A49784 |
| Benzonase nuclease | Millipore | Cat#: 70746 |
| POROS CaptureSelect AAV Affinity Resin | Thermo Fisher Scientific | Cat#: A36739 |
| DNase I | SIGMA | Cat#: DN25 |
| Bromodeoxyuridine (BrdU) | SIGMA | Cat#: B9285 |
| ISHpalette Short hairpin amplifier, Cyanine5-S72 | Nepagene | Cat#: IPL-B-C-S72 |
| protease inhibitor | Roche | Cat#: 11697498001 |
| PhosSTOP | Roche | Cat#: 04906837001 |
| Can Get signal 1 solution | TOYOBO | Cat#: NKB-101 |
| Chemilumi One Super | Nacalai Tesque | Cat#: 02230-30 |
| **实验模型：生物体/株系** | | |
| Dab1 flox mouse | 来自 Hideaki Imai 和 Yu Katsuyama 的馈赠 | N/A |
| C57BL/6N mouse | Japan SLC | RRID: IMSR_JAX:000664 |
| reeler mouse (B6CFe a/a-Relnrl/J) | The Jackson Laboratory | RRID: IMSR_JAX:000235 |
| reeler mouse (ICR) | 来自 Mitsuharu Hattori 的馈赠 | N/A |
| **重组 DNA** | | |
| pAAV-CAG-EGFP | 来自 Karel Svoboda 的馈赠 | RRID: Addgene_28014 |
| pAAV-CAG-EGFP-P2A-Cre | 本文 | N/A |
| pAAV-L7-6-EGFP | 来自 Hirokazu Hirai (Nitta et al.) 的馈赠 | N/A |
| pAAV-L7-EGFP-P2A-Cre | 本文 | N/A |
| pAAV-CAG-DIO | Honda et al. | N/A |
| pAAV-CAG-DIO-SHH | 本文 | N/A |
| **软件和算法** | | |
| Prism 11 for Windows | Graphpad | https://www.graphpad.com |
| ImageJ | NIH | https://imagej.net |

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实验模型和受试者细节

小鼠

Dab1 flox 小鼠由神户大学（日本神户）的 Hideaki Imai 博士和滋贺医科大学（日本大津）的 Yu Katsuyama 博士慷慨提供。它们维持在 C57BL/6 背景上，同窝 Dab1+/fl 小鼠作为所有 Dab1 cKO 实验的对照。因为小脑皱褶形成因品系而异，且为了匹配 Dab1 flox 系的遗传背景，使用 C57BL/6N 小鼠（从 Japan SLC 购买）作为野生型（图 6）。reeler (rl?/?) 小鼠 (B6CFe a/a-Relnrl/J; RRID: IMSR_JAX:000235) 最初来自 The Jackson Laboratory，并一直在我们的设施中维持。对于胚胎分析（图 5F–5I；图 S3），我们还使用了一条至少回交 10 代到 ICR 背景的 reeler 系，该系由...博士慷慨提供。

服部充春（名古屋市立大学）。所有小鼠饲养在无特定病原体（SPF）设施中，并在 12 小时光/暗循环（上午 8:30 开灯）和 24 °C 的环境下维持。所有动物实验程序均经庆应义塾大学机构动物护理和使用委员会批准（A2021-030），并遵循庆应义塾大学的机构指南及日本政府的动物实验法规进行。发现阴道栓当天的中午被定为胚胎第（E）0.5 天。本研究使用了两性小鼠。

方法细节

质粒
pAAV-CAG-EGFP-P2A-Cre 是从 pAAV-CAG-EGFP 骨架生成的（由 Karel Svoboda 赠予，Addgene 质粒 #28014；http://n2t.net/addgene:28014 RRID: Addgene_28014），方法是将原始的 EGFP 盒替换为一个表达盒，该表达盒是通过将 EGFP、P2A 肽连接子和 Cre 重组酶依次插入由 BamHI/HindIII 切除产生的修饰多重克隆位点组装而成。pAAV-L7-EGFP-P2A-Cre 是从 pAAV-L7-6-EGFP 生成的（由群马大学 Hirokazu Hirai 博士赠予）。bGH 多聚腺苷酸化信号被替换为 SV40 多聚腺苷酸化信号，并将源自 pAAV-CAG-EGFP-P2A-Cre 的 P2A-Cre 盒插入到 L7-6 启动子下游。为了生成 pAAV-CAG-DIO-SHH，从 E18.5 C57BL/6JJcl 小鼠大脑中提取总 RNA 并逆转录为 cDNA。然后使用以下引物通过 PCR 扩增小鼠 Shh 的编码序列：5′-gccaccatgctgctgctgctggccag-3′ 和 5′-tcagctggacttgaccgccattc-3'（Kozak 序列已下划线）。获得的产物克隆到 pAAV-CAG-DIO1 载体中。通过 Sanger 测序确认所有克隆连接点和开放阅读框。腺病毒辅助质粒 pADΔF6 和载体 pAAV2/9 由宾夕法尼亚大学 Penn Vector Core 慷慨提供。

AAV 生产与纯化
重组腺相关病毒（rAAV）采用两种方案生产和纯化。对于研究早期进行的实验，rAAV 的生产和纯化如前所述进行。简言之，收集转染后的 HEK293T 细胞，通过反复冻融循环裂解，并通过碘克沙醇梯度超速离心纯化病毒颗粒。在随后的实验中，使用 AAV-MAX Helper-Free AAV Production System（Thermo Fisher Scientific；货号 A49784）按照制造商的说明生产 rAAV。HEK293 衍生的病毒生产细胞 2.0 在病毒生产培养基中培养，并与 pADΔF6 和向量 pAAV2/9 一起转染穿梭质粒：pAAV-CAG-EGFP-P2A-Cre、pAAV-L7-EGFP-P2A-Cre 或 pAAV-CAG-DIO-SHH。转染 72 小时后，收集细胞和培养基，并用补充了 Benzonase 核酸酶（Millipore，货号 70746）的 AAV-MAX 裂解缓冲液裂解，随后使用 POROS CaptureSelect AAV 亲和树脂（ThermoFisher Scientific；货号 A36739）进行澄清和亲和纯化。在这两种方案中，洗脱的 rAAV 最终通过缓冲液交换至无菌 PBS，并使用 Vivaspin 离心浓缩器，100 kDa 截留分子量（Sartorius；货号 VS2042）进行浓缩。

病毒基因组滴度定量
为了测定基因组滴度，将纯化的 rAAV 样品依次用 DNaseI（SIGMA，货号 DN25）处理以去除未包装的 DNA，并用 Proteinase K 释放包装的病毒基因组。使用 StepOnePlus 实时 PCR 系统（Applied Biosystems）通过靶向 WPRE 序列的 TaqMan 探针法对病毒基因组进行定量。使用线性化的质粒 DNA 生成标准曲线。引物和探针序列列于表 S1 中。

AAV 注射
对于产后注射，将幼鼠置于冰上麻醉，并将 1.5 μL rAAV 与 0.01% 快绿混合后双侧递送至每个侧脑室。对于胚胎注射，通过腹腔注射麻醉剂混合物（间羟泮盐酸盐、咪达唑仑和布托啡诺）使孕鼠麻醉，并轻轻外翻子宫角。然后将 rAAV 单侧注射到 E15.0 胚胎的侧脑室中。所有注射均使用 Narishige IM-300 微量注射器和拉制的玻璃毛细管（Narishige, GD-1）进行。每个实验的注射体积和病毒基因组滴度总结在表 S2 中。

BrdU 标记
溴脱氧尿苷（BrdU; SIGMA, 货号 B9285）溶解在 sterile PBS 中浓度为 5-10 mg/mL，以 0.1 mg/g 体重（相当于 100 mg/kg）的剂量皮下注射给药于幼鼠。BrdU 给药 1 小时后收集小脑。

组织制备与切片
小鼠用磷酸盐缓冲液（PBS）经心脏灌注，随后用 0.1M 磷酸盐缓冲液（pH7.4）中的 4% 多聚甲醛（PFA）灌注。然后分离大脑并在冰上后置固定于 4% PFA 中（P5–P15 为 2 小时；P0–P4 为 1 小时）。小脑的立体显微镜图像在将溶解于 PBS 中的 0.03% 快绿应用于代表性样本以增强小脑裂隙的对比度后采集。用 PBS 洗涤后，组织在 25% 蔗糖/PBS 中过夜冷冻保护，包埋在最佳切割温度（OCT）化合物（Sakura Finetek）和 30% 蔗糖/PBS 的混合物中，并在液氮中冷冻。使用 Leica CM3050 S 切片机以 20 μm 厚度冠状切片切割冷冻切片。

免疫组织化学
冷冻切片置于室温，用 PBS 冲洗，并在需要时进行抗原修复（柠檬酸盐缓冲液，105 °C 10 分钟）。然后将切片在封闭液（PBS 中的 5% 驴血清和 0.1% Triton X-100；抗 SHH 染色使用 0.3% Triton X-100）中室温孵育 30 分钟。一抗用相应的封闭液稀释，并在 4 °C 过夜孵育。PBS 洗涤后，切片在室温下与物种特异性荧光二抗孵育 2 小时，用 DAPI 复染，并用 PermaFluor（Thermo Fisher Scientific）封片。本研究中使用的—抗和二抗列于表 S3 中。

荧光原位杂交
使用 ISH palette HCR 试剂盒（Nepagene, 日本）按照制造商的协议进行基于杂交链反应（HCR）的荧光原位杂交。针对 Shh 和 Gli1 的编码序列设计了与 HCR 扩增启动子序列连接的分裂探针（表 S4）。将冷冻切片（20 μm）置于室温，用 PBS 冲洗，在 100% 甲醇中脱水 10 分钟，并在含 0.1% Tween 20 的 PBS（PBST）中复水。在杂交缓冲液（Nepagene）中孵育 5 分钟后，将靶向 Shh 或 Gli1 的分裂探针组稀释在杂交缓冲液中，并在 37°C 下杂交过夜。杂交后，切片在含 0.1% Tween 20 的 0.5× SSC（SSCT）中于 37 °C 洗涤（3 × 10 分钟）。通过将切片与 ISH 短发夹扩增子（IPL-B-C-S72）一起与 DAPI 在室温下孵育 2 小时进行信号扩增。最后用 PBST 洗涤切片，并用 PermaFluor（Thermo Fisher Scientific）封片。

小脑裂解液的蛋白质印迹分析
小脑在冰冷的 PBS 中快速解剖，并在组织裂解缓冲液[50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 150 mM NaCl, 10% 甘油, 1% Triton X-100, 50 mM NaF, 和 1 mM Na3VO4]中补充蛋白酶抑制剂（Roche, 货号 11697498001）和 PhosSTOP（Roche, 货号04906837001），使用 pellet mixer 进行匀浆。样品使用超声处理器（Bioruptor UCD-200TM, Cosmo Bio; 15 秒开/15 秒关，10 分钟）进一步裂解。提取物在 4°C 下以 15,000 rpm 离心 15 分钟澄清。蛋白质样品与 4× Laemmli 样品缓冲液混合，在 95°C 煮沸 5 分钟，并在 4-20% 聚丙烯酰胺凝胶上进行 SDS-PAGE。蛋白质转移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。膜在 PBST（PBS 中的 0.05% Tween 20）中的 5% BSA 中封闭 30 分钟，并在摇床上用稀释于 Can Get signal 1 溶液（TOYOBO, 货号 NKB-101）中的一抗在 4°C 过夜孵育。用 PBST 洗涤后，膜在室温下与 PBST 中的辣根过氧化物酶偶联二抗在摇床上孵育 1 小时。使用 Chemilumi One Super（Nacalai Tesque, 货号 02230-30）检测信号，并使用冷却 CCD 相机系统（LAS-4000 mini; GE Healthcare）捕获。通过测量每个条带的积分光密度，减去同一泳道的背景，并归一化至作为 PC 特异性装载参考的 Calbindin 的减背景积分光密度来量化相对条带强度。使用的以下一抗为：抗 SHH（小鼠；Santa Cruz, sc-365112; 1:100）和抗 Calbindin（兔；Nittobo, MFSR100390; 1:5,000）。HRP 偶联二抗购自 Jackson ImmunoResearch（抗小鼠，115-035-003; 抗兔，111-035-003; 1:1,000）。

定量与统计分析

图像定量
图像定量使用 ImageJ 软件（NIH）进行。主要裂隙和次要裂隙的裂隙深度测量是在小脑蚓部的中线矢状切片上进行的，定义为看不见小脑核的切片。裂隙深度测量为从裂隙底部到软脑膜表面的距离。对于 spf 测量，每个小脑分析间隔 160 μm 的四个小脑蚓部矢状切片，并使用最大 spf 深度进行定量。这些切片从小脑蚓部的中线跨越到小脑白质与脑桥之间的连续性变得可见的水平之前。EGFP 阳性 PC 与 ML 之间的距离通过测量每个细胞从 PC 胞体中心到每个小叶浅部区域 ML 下边界的距离来量化。为了量化 EGL 厚度，将小脑蚓部的中线矢状切片裁剪为沿 EGL 的 150-μm 宽区域。在这个区域内三个预定的、均匀间隔的位置测量 EGL 厚度，并使用平均值进行分析。对于 BrdU 分析，将小脑蚓部的中线矢状切片裁剪为 EGL 的外 150 μm。计数该区域内的 BrdU 阳性和 DAPI 阳性细胞。BrdU 定量在图像裁剪后以盲法进行。SHH 和 Calbindin 的荧光强度在单个 PC 中量化。对于归一化至 Calbindin 的 SHH IHC 定量，测量胞体内的平均强度，同时排除 DAPI 阳性核区域。由于 Dab1 cKO 样品有明显的 PC 错位，完全盲法不可行；因此，所有测量均使用预定义的客观标准进行。

统计分析
所有统计分析使用 GraphPad Prism（GraphPad Software）进行。数据通常表示为均值 ± 标准差，并使用双尾韦尔奇 t 检验评估统计显著性。对于涉及多个因素或组的比较，PC–ML 距离跨小叶的分析（图 1J 和 1R；图 S1G）使用带有 Sidák 多重比较检验的双因素方差分析，reeler 小鼠 EGL 厚度的分析（图 3F 和 3G）使用带有 Tukey 多重比较检验的单因素方差分析。对于显示大方差的数据集，图 2I、7D 和 7E 中的裂隙深度测量使用曼-惠特尼 U 检验分析，并表示为中位数和四分位距。对于所有实验分析，每个 n 代表一只小鼠。p 值小于 0.05 被认为是显著的。所有显著的统计结果在图中用以下惯例指示：?p < 0.05, ??p < 0.01, ???p < 0.001, ????p < 0.0001。确切的 n 值和使用的统计检验在图注中指示。确切的 p 值、检验统计量（t、U 和 F 值）和自由度（对于 t 检验和方差分析）在表 S5 中提供。

补充信息 (1)PDF (3.57 MB)文档 S1. 图 S1–S3 和表 S1–S5