银鲈鱼脾脏中的免疫级联反应：从抗原处理到细胞毒性激活——在光杆菌（Photobacterium damselae）damselae亚种感染期间

《Aquaculture》：A phased immune cascade in the silver pomfret spleen: from antigen processing to cytotoxic activation during Photobacterium damselae subsp. damselae infection

　　**摘要**
Photobacterium damselae subsp. damselae (PDD) 会引起养殖银鲷 (Pampus argenteus) 的出血性疾病和死亡，但脾脏免疫激活与组织损伤之间的时间关系仍不清楚。本研究结合了时间分辨的组织病理学、基于图像的客观量化分析、脾脏转录组学、功能富集和网络分析以及分子验证，以表征 PDD 感染后的免疫反应。15 个 RNA-seq 文库共产生了 642,398,433 个高质量读段，其平均 Q30 值和 GC 含量分别为 96.27% 和 46.71%。组织病理学显示出现了渐进性的充血、炎症细胞积聚、囊泡/结构松散变化以及结构破坏。客观量化分析表明，损伤面积主要在感染后 72–96 小时 (hpi) 增加，而核/细胞密度指数在感染后 72 小时达到最高值。相反，转录反应在感染后 48 小时达到峰值，此时鉴定出 2863 个差异表达基因。功能分析揭示了细胞因子-受体相互作用、造血细胞谱系、吞噬体-溶酶体功能、抗原处理和呈递以及细胞毒性相关程序的阶段性变化。共表达和蛋白质相互作用分析进一步确定了连接炎症信号传导、囊泡处理、细胞应激、抗原呈递和细胞毒性效应子的中间和晚期模块。Western blot 结果显示，MHC2 和 LCK 蛋白在感染后 48–72 小时的表达量增加，而 HSP90 的表达也上调。RT-qPCR 验证了 CD3D、TRBV、LCK、PRF1 和 GZMB 在感染后显著上调，其中最强的反应通常发生在感染后 96 小时。这些结果支持脾脏免疫反应具有阶段性特点：早期的转录重编程和中期的抗原处理及淋巴细胞信号传导反应先于组织损伤的累积，随后是 PRF1/GZMB 相关的细胞毒性效应子的动员。这一时间框架为未来针对银鲷抗菌免疫的细胞水平功能研究提供了候选免疫标记物和有意义的采样窗口。

**引言**
银鲷 (Pampus argenteus) 是一种具有商业价值的海洋鱼类，广泛分布于中国及其他亚洲地区的沿海水域。在中国，它分布于大部分沿海区域，因其细腻的肉质、高营养价值以及强烈的市场需求而备受重视，成为具有重要水产养殖潜力的一种重要海洋鱼类（Davis 和 Wheeler, 1985; Zhao 等, 2011; Hu 等, 2024）。近年来，人工繁殖、幼体培育、选择性育种和基因组资源开发方面的进展推动了银鲷从捕捞转向可控水产养殖和遗传改良（Al-Abdul-Elah 等, 2021; Zhang 等, 2022; Hu 等, 2024; Qin 等, 2025; Qiao 等, 2025）。关于喂养调节、营养改善以及对病原体挑战的免疫反应的相关研究也为银鲷养殖和健康管理提供了宝贵的生物参考（Hu 等, 2021; Li 等, 2023; Zhang 等, 2024; Li 等, 2024; Yan 等, 2025）。然而，传染病仍然是该物种稳定大规模养殖的主要障碍。在密集养殖条件下，细菌病原体可能迅速传播并造成重大经济损失，其中 Photobacterium damselae subsp. damselae (PDD) 是威胁银鲷养殖的主要细菌病原体之一。在水产养殖中，PDD 感染常伴随出血性病变、溃疡、败血症进展、组织损伤和急性死亡，对养殖海洋鱼类构成新的威胁（Rivas 等, 2013; Tao 等, 2018; Osorio 等, 2018）。如果不能及时发现和控制疫情，疾病进展可能迅速，严重情况下死亡率可能接近甚至超过 90%（Rivas 等, 2013; Tao 等, 2018; Su 和 Chen, 2022; Petchimuthu 等, 2022）。因此，明确银鲷对 PDD 感染的系统免疫反应对于理解宿主抗菌防御机制以及识别有助于疾病控制、健康管理和抗病育种的免疫标记物至关重要。

PDD 是一种嗜盐革兰氏阴性细菌，属于 Vibrionaceae 科，被广泛认为是一种机会性海洋病原体，具有广泛的宿主范围。其致病性主要归因于多种溶血性和细胞毒性毒力因子，包括质粒编码的 damselysin 和 HlyA/phobalysin 相关毒素，以及染色体编码的溶血素和磷酸脂酶相关决定因子（Rivas 等, 2011; Rivas 等, 2015; Osorio 等, 2018）。这些因子可损伤宿主细胞、破坏组织完整性并促进病原体的全身传播。重要的是，PDD 诱导的损伤可能超出局部病变范围，影响免疫器官和免疫细胞功能。最近在银鲷中的研究表明，PDD 毒力因子可能通过损害吞噬体相关的抗菌过程促进免疫逃逸（Zhang 等, 2024）。因此，PDD 感染可能导致宿主层面的广泛免疫逃逸现象，其中细菌的细胞毒性、免疫器官损伤和吞噬清除功能紊乱共同削弱了抗菌防御。鉴于这一致病特性，脾脏成为研究银鲷在 PDD 感染期间如何协调病原体清除、抗原处理和全身免疫调节的关键窗口。

在硬骨鱼类中，脾脏是主要的次级淋巴器官，兼具血液过滤、免疫监视、抗原保留、巨噬细胞介导的清除以及适应性免疫反应的启动功能（Zapata 和 Amemiya, 2000; Bj?rgen 和 Koppang, 2021）。这些功能使脾脏成为全身抗菌防御的中心，但在败血症感染期间，它们也可能增加宿主暴露于循环细菌和病原体来源因子的可能性。鉴于 PDD 的败血症进展和细胞毒性潜力，脾脏可能会同时接触到微生物抗原和感染过程中产生的组织损伤相关信号。因此，脾脏不仅作为细菌清除的免疫效应器官，也可能成为受 PDD 诱导的免疫和结构损伤影响的潜在目标器官。在这种情况下，脾脏巨噬细胞和其他抗原呈递细胞可能通过保守的 MHC I 类和 II 类相关途径捕获、处理并呈递微生物或损伤相关抗原，从而将先天性的细菌清除与下游淋巴细胞激活联系起来（Nakanishi 等, 2015; Johnstone 和 Chaves-Pozo, 2022）。同时，硬骨鱼 CD8+ T 细胞和 T/NK 类淋巴细胞保留了保守的细胞毒性程序，包括 perforin 和 granzyme 相关的效应机制，这些机制可能在感染过程中帮助清除受感染、应激或受损的宿主细胞（Somamoto 等, 2014; Chaves-Pozo, 2019）。因此，脾脏的抗原处理、吞噬体相关防御和细胞毒性淋巴细胞相关反应可能是银鲷对 PDD 的全身免疫反应的关键组成部分。然而，这些过程在银鲷脾脏中的时间协调机制尚不明确，这突显了对该宿主-病原体系统中脾脏免疫反应进行时间分辨分析的必要性。

为了进一步研究银鲷对 PDD 的完整免疫反应，本研究结合了时间分辨的组织病理学和转录组学分析，分析了感染后 0、24、48、72 和 96 小时的脾脏免疫反应，并额外设置了 7 天的时间点进行分子验证。通过差异表达、功能富集、基因集富集、加权共表达网络和蛋白质-蛋白质相互作用分析，鉴定了特定阶段的免疫程序和关键分子候选物。这些发现建立了银鲷在 PDD 感染期间全身抗菌免疫的时间框架，揭示了硬骨鱼类如何协调先天炎症、抗原呈递和细胞毒性淋巴细胞反应以应对细菌入侵，并为水产养殖健康管理和抗病育种提供了 valuable 参考。

**实验部分**
健康的成年银鲷（六个月大；平均体长 13.2 ± 1.3 cm；平均体重 45.5 ± 4.8 g）从中国宁波的象山港水产养殖有限公司获取。鱼类在配备循环过滤海水的 3000 L 水箱中适应环境。在适应和感染期间，水温、pH 值、溶解氧和盐度分别维持在 26 ± 0.4 °C、8.21 ± 0.5、7.73 ± 0.52 mg/L 和 25 ± 0.7‰。

**PDD 感染导致银鲷脾脏组织病理学损伤**
PDD 感染导致银鲷脾脏出现时间依赖性的组织病理变化（图 1）。对照组脾脏组织结构紧密，无明显病理损伤。感染后 24 小时，观察到轻微的组织松散、局部炎症细胞积聚和散在的囊泡变化及巨噬细胞样细胞。感染后 48 小时，囊泡退化和局部出血/充血变化更加明显，巨噬细胞相关改变也随之增加。感染后 72 小时，转录反应达到峰值，随后脾脏损伤加剧。

**转录反应与组织损伤的时间差异**
本研究最显著的特征是转录反应峰值与随后脾脏损伤之间的时间差异。PDD 感染在感染后 24 小时诱导出 683 个差异表达基因 (DEGs)，随后在感染后 48 小时增加到 2863 个，感染后 72 小时降至 1820 个，感染后 96 小时降至 766 个。组织损伤的发展轨迹不同：炎症浸润在感染后 72 小时最为明显，而囊泡退化和组织破坏在感染后 96 小时达到最严重程度。

**结论**
本研究提供了银鲷在 PDD 感染后脾脏免疫重塑的时间分辨视图。转录反应在感染后 48 小时达到峰值，涉及炎症信号传导、造血细胞谱系、抗原处理和呈递、吞噬体/溶酶体功能以及细胞毒性免疫途径的动态富集。WGCNA 和 PPI 分析将反应分为炎症信号传导、抗原呈递/囊泡转运和细胞毒性-淋巴细胞相关部分。

**作者贡献声明**
Yuanbo Li：撰写——原始草案、方法学、调查、正式分析、数据管理、概念化。
Denggui Chen：软件、方法学。
Xiang Chen：调查、正式分析。
Zhixuan Lu：数据管理。
Man Zhang：方法学。
Youyi Zhang：正式分析、数据管理。
Jiabao Hu：资金获取、正式分析、概念化。
Yajun Wang：可视化、资金获取、正式分析。
Xiaojun Yan：撰写——审阅与编辑、验证。

**伦理声明**
本研究遵循 ARRIVE（动物研究：体内实验报告）指南进行。
该研究获得了宁波大学动物伦理与福利委员会 (AEWC) 的批准（批准编号：AEWC-NBU20220079）。

**利益声明**
作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的研究工作。