6:2 diPAP对大肠杆菌K12的毒性受到acrB外排泵的调控

《Aquatic Toxicology》：The toxicity of 6:2 diPAP to E. coli K12 is regulated by the acrB efflux pump

　　

摘要

多氟烷基磷酸酯（PAPs）是一类新兴的全氟和多氟烷基物质，但关于其对细菌的毒性研究尚不充分。本研究将野生型（WT）和具有acriflavine抗性的ΔacrB株（acrB）的大肠杆菌K12暴露于6:2 diPAP（一种常见的PAP）中。在没有acrB的情况下，6:2 diPAP的细胞内浓度会增加。在个体水平上，1 nmol L^-1的6:2 diPAP显著抑制了WT菌株的生长，并提高了活性氧的水平。在没有acrB的情况下，0.1和1 nmol L^-1的6:2 diPAP的抑制和促进作用比WT菌株更为明显。在群体水平上，0.1和1 nmol L^-1的6:2 diPAP促进了WT菌株的生物膜形成，而抑制了ΔacrB菌株的生物膜形成。S-ribosylhomocysteine lyase、运动蛋白A和ybaJ的表达与生物膜形成趋势一致，而色氨酸酶和溶血素表达调节蛋白的表达则呈现相反趋势。结果表明，6:2 diPAP通过调节这些基因的表达来影响生物膜的形成。与生物膜形成相关的，1 nmol L^-1的6:2 diPAP激活了WT菌株的谷胱甘肽（GSH）代谢，而抑制了ΔacrB菌株的谷胱甘肽代谢。通过添加四种与谷胱甘肽代谢相关的代谢物，可以部分恢复ΔacrB菌株的生物膜形成缺陷，这进一步证实了谷胱甘肽代谢在生物膜形成中的作用。我们的研究表明，acrB在6:2 diPAP对大肠杆菌的毒性中起着不可或缺的作用，特别是在环境相关浓度下。

引言

自21世纪初以来，基于N-ethyl全氟辛烷磺胺乙醇的磷酸酯就受到了监管（Langberg等人，2021年）。此后，多氟烷基磷酸酯（PAPs）作为其替代品被生产和使用。作为一类新兴的全氟和多氟烷基物质（PFASs），PAPs被广泛应用于各种消费品中，如食品接触材料、化妆品、纸制品、涂料和农药成分（Ao等人，2024年；Namazkar等人，2024年；USEPA，2006年）。在生产、使用和处置过程中，PAPs可能会释放到环境中。在某些环境基质中，检测到高浓度或高检出率的PAPs。例如，在车辆空调系统中，PAPs占∑PFASs的45%，其中6:2 diPAP是含量最高的成分（中位数45.9 ng g^-1，检出率：93%）（Arnold等人，2025年）。∑PAPs的中位浓度（299 ng g^-1）是全氟烷基羧酸总浓度的3倍（111 ng g^-1），是全氟烷基磺酸浓度的38倍（7.93 ng g^-1）（Harris等人，2022年）。有研究表明，PAPs在体外（Rosenmai等人，2013年）、马尼拉蛤蜊（Guo等人，2023年）和斑马鱼（Chen等人，2019年、2020年、2024a年）中具有毒性。因此，PAPs的环境风险需要得到充分关注。

沿海地区是PAPs进入海洋的主要途径。由于人类活动，越来越多的PAPs从陆地迁移到沿海地区，并在那里被检测到。在渤海和珠江三角洲的海水样本中发现了6:2 diPAP（Kwok等人，2015年；Li等人，2020年）。这些结果表明，沿海地区已被PAPs污染。

细菌是生态系统的重要组成部分，在生物地球化学循环中起着关键作用（Li等人，2024年）。然而，PAPs对细菌的生态毒性仍不清楚。欧盟选择大肠杆菌作为评估沿海污染的指示微生物（Price和Wildeboer，2017年）。在全氟辛酸（PFOA）浓度非常高的情况下，其对大肠杆菌的毒性大于全氟辛烷磺酸（PFOS）（Liu等人，2016年）。然而，关于PAPs（全氟烷基羧酸的前体）对大肠杆菌的毒性，尤其是在环境相关浓度下的毒性，知之甚少。

大肠杆菌能够组装成生物膜群落，以帮助自己抵御外部压力。生物膜的形成涉及黏附、成熟、胞外聚合物基质的产生以及浮游细胞的扩散（Ren等人，2024年）。研究表明，参与大肠杆菌生物膜形成的还有外排泵（Baugh等人，2014年；Matsumura等人，2011年）。然而，外排泵如何影响生物膜形成的机制尚未完全弄清楚。目前尚不清楚PAPs是否通过作为底物或调节因子与外排泵相互作用来影响生物膜形成。

Acriflavine抗性B（AcrB）是大肠杆菌中的主要多重药物外排蛋白，它可以识别多种底物，如双酚A及其类似物（Chen等人，2025c；Li等人，2015年）和抗生素（Vergalli等人，2020年）。构建了ΔacrB菌株以研究acrB在PAPs对大肠杆菌毒性中的作用。在所有已鉴定的PAPs中，6:2 diPAP最为常见（Ao等人，2024年）。本研究将野生型（WT）和ΔacrB菌株分别暴露于两种环境相关浓度（0.1和1 nmol L^-1）的6:2 diPAP中，探讨了6:2 diPAP对生物富集、生长、活性氧生成和生物膜形成的影响。通过代谢组学研究，揭示了多重药物外排与生物膜形成之间的机制。

章节片段

化学品和菌株

6:2 diPAP（50 mg L^-1，溶于甲醇）购自加拿大安大略省圭尔夫的Wellington实验室。大肠杆菌K12的WT菌株在37°C下于Luria-Bertani（LB）培养基中培养。ΔacrB菌株是通过pDM4载体构建的（An等人，2023年）。

培养基和菌株中6:2 diPAP的定量

具体细节见支持信息。培养基中6:2 diPAP的测量浓度为标称浓度的86% - 95%（表S1）。因此，使用了标称浓度的6:2 diPAP。

WT菌株中的acrB表达

暴露后acrB的水平

6:2 diPAP对WT菌株中acrB水平的影响

与对照组相比，0.1 nmol L^-1的6:2 diPAP显著降低了acrB的水平，而在1 nmol L^-1的6:2 diPAP下则显著升高（图1a）。随着6:2 diPAP浓度从0.1增加到1 nmol L^-1，acrB的表达最初下降后再次上升，显示出U形的剂量反应（图1a）。类似地，PFOS和PFOA在水生生物中也常引起这种剂量-反应关系（Sun等人，2024年）。AcrB中有五个候选位点（位点1-5）

结论

本研究比较了WT和ΔacrB大肠杆菌菌株对环境相关浓度下6:2 diPAP的不同反应。删除acrB后，6:2 diPAP的生物富集增加，表明acrB参与了跨膜转运。与WT菌株相比，处于浮游状态的ΔacrB菌株对0.1和1 nmol L^-1的6:2 diPAP更敏感，表现为更明显的生长抑制和氧化应激。

作者声明

陈鹏宇：概念构思、监督、经费获取、方法学设计、初稿撰写、审稿与编辑。窦志超：数据管理、软件操作。严克珍：资源协调。洪伟：监督、方法学设计、项目管理、审稿与编辑。

数据可用性

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补充材料

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CRediT作者贡献声明

陈鹏宇：撰写——审稿与编辑、初稿撰写、监督、方法学设计、经费获取、概念构思。窦志超：软件操作、数据管理。严克珍：资源协调。洪伟：审稿与编辑、监督、项目管理、方法学设计。

Pengyu Chen|Zhichao Dou|Kezhen Yan|Wei Hong

中国南京毫海大学海洋学院，210024