多重qPCR与BclA基因长度多态性分析联合策略用于区分炭疽芽孢杆菌野生型与疫苗株

《Microbiology Spectrum》：An integrated strategy of multiplex qPCR and BclA gene length polymorphism analysis for differentiating Bacillus anthracis wild-type and vaccine strains

　　

摘要
研究人员开发了一种联合分子策略，用于准确区分炭疽芽孢杆菌（Bacillus anthracis）的野生型与疫苗株。该方法将靶向BclA、sap和cap基因的多重TaqMan qPCR检测与BclA片段长度多态性的常规PCR分析相结合。该qPCR检测方法具有高特异性，与其他常见病原体无交叉反应，并且三个靶标均表现出一致的检测限（limit of detection, LOD）为2.11 × 10¹ copies/μL（Cq < 35）。其重复性优异，批内和批间变异系数（coefficient of variation, CV）分别低于1.96%和3.06%。使用19株野生型菌株进行验证，研究人员发现了两种不同的qPCR图谱，并且所有野生型菌株均通过其特征性BclA扩增子大小，与产荚膜的中国疫苗株II和无荚膜的Sterne株明确区分。通过对全球常见canSNP基因分型（A、B和C群）的代表性菌株进行模拟PCR验证，该方法能够区分中国的野生型与疫苗株。这种“多重qPCR–BclA长度分析”联合方案为在中国精确检测和区分炭疽芽孢杆菌菌株提供了可靠、灵敏且特异的工具。

### 炭疽芽孢杆菌野生型与疫苗株鉴别新策略：多重qPCR联合BclA基因长度多态性分析

#### 研究背景与问题

炭疽是由炭疽芽孢杆菌（Bacillus anthracis）引起的一种严重人畜共患传染病，对人类健康和畜牧业安全构成持续威胁。炭疽芽孢杆菌能形成芽孢，在环境中可存活数十年，这为其长期传播埋下隐患。目前，炭疽的诊断方法包括细菌培养、免疫学检测和多种核酸扩增技术（如PCR、qPCR和等温扩增）。然而，现有方法大多仅能确认菌种，却难以区分野生型菌株与减毒疫苗株。在中国，减毒活疫苗被广泛用于动物免疫，普遍使用的中国疫苗株II（CVCC40202，pXO1⁺、pXO2⁺，A.Br.008/009）和无荚膜Sterne株34F2（CVCC40205，pXO1⁺、pXO2^?，A.Br.001/002）可能在疫苗接种或泄漏后以芽孢形式持续存在于环境中。因此，检测到的芽孢究竟来源于自然暴发还是历史疫苗使用，往往难以判定，严重阻碍了疫情调查和溯源工作。为解决这一诊断难题，研究人员开发了一种整合多重TaqMan qPCR与BclA基因长度多态性分析的联合策略，旨在实现野生型与疫苗株的精确区分，为炭疽疫情的流行病学溯源和精准防控提供可靠工具。

#### 研究方法概述

研究人员从中国长春兽医研究所菌种库获得实验菌株，包括两株疫苗株（中国疫苗株II和无荚膜Sterne株34F2）及19株野生型菌株（2009至2021年间分离自中国多个省份的不同宿主）。针对sap、cap和BclA基因的保守区域设计引物和TaqMan探针，构建重组质粒标准品（pMD19-sap、pMD19-cap和pMD19-BclA），经PCR验证和Sanger测序确认后用于后续优化。研究人员系统优化了单重及多重qPCR的引物探针浓度和退火温度，用十倍梯度稀释的标准质粒测定标准曲线、敏感性和重复性，并采用11株非炭疽芽孢杆菌菌株评估特异性。多重qPCR完成后，继续对BclA基因进行常规PCR扩增并进行琼脂糖凝胶电泳，通过扩增片段长度差异区分菌株。此外，研究人员利用NCBI数据库中的代表性全球菌株基因组，对WHO、P. Keim、H. Ogawa和T. Zorigt等报道的引物及本研究设计的BclA引物进行模拟PCR比较分析。

#### 研究结果

**质粒标准品的制备**
研究人员成功构建了pMD19-BclA、pMD19-cap和pMD19-sap三种重组质粒，浓度分别为161.1、219.7和311.0 ng/μL，对应拷贝数为4.32 × 10¹⁰、5.67 × 10¹⁰和8.52 × 10¹⁰ copies/μL。PCR和Sanger测序验证表明各质粒完整且特异，可作为后续优化和验证实验的标准品。

**多重qPCR检测方法的优化**
经系统优化，最终确定20 μL多重qPCR反应体系。扩增程序为：37℃孵育120 s，95℃预变性30 s，随后45个循环（95℃变性5 s，58℃退火延伸30 s）。该优化体系可实现三个靶标基因的均衡共扩增。

**多重qPCR标准曲线**
对10倍梯度稀释（10⁷至10⁰ copies/μL）的标准质粒进行分析，三个靶标的扩增曲线均呈典型S形，标准曲线线性良好：sap基因y = –3.4455x + 38.806（R2 = 0.996），cap基因y = –3.5656x + 38.824（R2 = 0.9977），BclA基因y = –3.5452x + 39.05（R2 = 0.9956）。

**分析特异性**
使用11株非炭疽芽孢杆菌菌株评价特异性，sap和cap靶标均无交叉反应（Cq ≥ 36或未检出）。仅蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）在BclA靶标出现特异性扩增信号（Cq = 22.75），该“BclA阳性、sap和cap阴性”的独特图谱可清晰区分炭疽芽孢杆菌与近缘种，证实了多重检测方法具有高特异性。

**野生型与疫苗株的联合鉴定**
多重qPCR分析显示：中国疫苗株II三个靶标均为阳性；无荚膜Sterne株34F2仅sap阳性；野生型HC1株sap和cap阳性但BclA阴性；野生型SX1株与疫苗株II呈现相同qPCR图谱。进一步对BclA基因进行常规PCR扩增，结果显示扩增片段大小各异：Sterne株约729 bp、中国疫苗株II约315 bp、两种野生型菌株约675 bp。将qPCR图谱与BclA片段长度多态性结合后，可对上述菌株进行明确的鉴别诊断。

**多重qPCR敏感性**
以标准质粒十倍稀释梯度评估敏感性，三个靶标均表现出高灵敏度，各质粒的一致检测限（LOD）为2.11 × 10¹ copies/μL（Cq < 35）。单重与多重qPCR的Cq值在各浓度水平上具有可比性。

**分析重复性**
三批独立实验结果显示，批内变异系数均低于1.96%，批间变异系数均低于3.06%，证明该多重qPCR检测方法具有良好的重复性和稳定性能。

**野生型菌株验证**
研究人员对19株野生型炭疽芽孢杆菌进行检测，发现两种qPCR图谱类型：11株菌株为sap和cap阳性、BclA阴性；其余8株为三个靶标均阳性。所有野生型菌株经BclA常规PCR扩增均获得约675 bp的单一条带，与中国疫苗株II的315 bp条带及无荚膜Sterne株34F2的729 bp条带差异显著，成功实现全部菌株的鉴别。

**代表性全球菌株的模拟PCR比较**
使用现有文献中WHO、Keim、Ogawa和Zorigt报道的引物进行模拟PCR，这些方法虽能区分缺乏pXO1或pXO2质粒的疫苗株与野生型，但无法鉴别同时携带两种毒力质粒的疫苗株。使用本研究设计的BclA引物进行模拟PCR，中国疫苗株II产生315 bp扩增产物，与全球其他野生型和疫苗株扩增产物大小（198~729 bp）均不相同。尽管个别罕见基因型（如Canadian bison和Carbosap）也产生315 bp片段，但这些基因型在中国极为少见，不影响该方法的实际应用。

#### 总结与讨论

该研究建立的多重qPCR与BclA基因长度多态性联合分析策略，成功解决了现有分子诊断方法无法区分同时携带两种毒力质粒的疫苗株与野生型菌株这一关键问题。该方法将实时PCR的快速灵敏性与BclA基因片段长度多态性的高分辨率有效结合，通过两步流程即可实现可靠鉴别。在中国流行病学背景下，绝大多数野外分离株属于A.Br.001/002或密切相关的A.Br.Ames亚系，其BclA扩增产物特征性大小（675 bp）与疫苗株存在显著差异，因此该方法具有明确的应用优势。该研究为炭疽流行病学调查和防控工作提供了切实可行的技术方案，对提升炭疽疫情的溯源能力和公共卫生防御水平具有重要意义。

#### 研究结论

本研究开发并验证了一种整合多重TaqMan qPCR与BclA基因长度多态性分析的分子策略，可准确区分炭疽芽孢杆菌野生型与疫苗株。该方法具有高特异性、高灵敏度和良好重复性，在中国流行病学背景下能够可靠鉴别野生型菌株与产荚膜的中国疫苗株II以及无荚膜Sterne株。该联合方案为炭疽疫情监测和菌株溯源提供了实用、有效的诊断工具，有助于精确的流行病学调查与防控决策。该成果发表在《Microbiology Spectrum》。