《Microbiology Spectrum》：Diagnostic value of lesion-targeted BALF immune biomarkers combined with T-SPOT.TB for smear-negative pulmonary tuberculosis
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关于病灶局部感染部位免疫反应的数据在涂阴肺结核（smear-negative pulmonary tuberculosis, SNPT）中仍较有限。本研究旨在表征病灶靶向支气管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid, BALF）细
关于病灶局部感染部位免疫反应的数据在涂阴肺结核（smear-negative pulmonary tuberculosis, SNPT）中仍较有限。本研究旨在表征病灶靶向支气管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid, BALF）细胞因子与T细胞反应，并评估其对临床疑似SNPT患者的诊断价值。研究人员于2021年1月至2023年12月在单中心推导队列纳入患者，检测外周血与病灶靶向BALF中的细胞因子及淋巴细胞亚群，并行外周血T-SPOT.TB检测与BALF靶向二代测序（targeted next-generation sequencing, tNGS）检测结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis, Mtb）。在推导队列中构建基于BALF免疫生物标志物与外周血T-SPOT.TB结果的免疫预测模型，并于2024年6月至2025年5月在三中心外部验证队列中验证。推导队列177例（SNPT 69例，非SNPT 108例）中，逐步logistic回归确定BALF中IL-1β与IL-6浓度、BALF CD4/CD8 T细胞比值及T-SPOT.TB结果为SNPT独立预测因子，组成免疫预测模型，曲线下面积（area under the curve, AUC）为0.856；在最优预测概率切点0.36处，较单独T-SPOT.TB将特异性从66.7%提升至85.2%。外部验证队列177例（SNPT 67例，非SNPT 110例）中模型AUC为0.801，灵敏度71.6%，特异性82.7%。BALF tNGS并联预测模型后灵敏度94.0%、特异性78.0%，优势比（odds ratio, OR）56.4（95% CI, 18.7–170.8），优于单独tNGS（OR 18.7）。测定BALF IL-1β、IL-6浓度与CD4/CD8 T细胞比值并联合T-SPOT.TB结果，有助于SNPT诊断及抗Mtb治疗的及时启动。
研究背景与立题依据：活动性肺结核（pulmonary tuberculosis, PTB）由结核分枝杆菌复合群（Mycobacterium tuberculosis complex, Mtb）引起，涂阴肺结核（SNPT）占活动性PTB的30%–60%，因菌量低、临床影像不典型常漏诊，导致诊疗延迟60–90天。痰抗酸杆菌（acid-fast bacillus, AFB）涂片敏感性不足，Xpert MTB/RIF在少菌样本中敏感性有限，Xpert Ultra虽提升敏感性但仍不够；BALF靶向二代测序（tNGS）可互补检测Mtb与非结核分枝杆菌（non-tuberculous mycobacteria, NTM），但核酸痕量阳性可致假阳。外周血干扰素γ释放试验如T-SPOT.TB仅反映致敏状态，不能区分活动性PTB与潜伏结核感染（latent tuberculosis infection, LTBI）。既往免疫研究多基于外周血，未能体现感染灶局部免疫特征。研究人员假设病灶靶向BALF免疫特征可独立预测SNPT，并与T-SPOT.TB联合提升诊断准确性，故开展本研究。论文发表于《Microbiology Spectrum》。
主要关键技术方法：研究为前瞻性两项独立队列——单中心推导队列（2021年1月至2023年12月，非HIV成人18–80岁，疑似SNPT且三次痰AFB涂片阴性、行病灶靶向支气管镜灌洗）与三中心外部验证队列（2024年6月至2025年5月）。SNPT定义含培养确诊或排除他病后抗Mtb治疗6个月临床放射学改善；非SNPT含细菌性肺炎、肺癌、NTM肺病、结节病等。检测手段包括外周血T-SPOT.TB（ESAT-6/CFP-10斑点形成细胞）、BALF与外周血细胞因子（IL-1β、IL-6、IFN-γ等12项）流式定量、BALF淋巴细胞亚群（CD4/CD8及CD4+CD29+、CD8+CD28+）流式分析、BALF tNGS（TB Pro assay，Illumina NextSeq 550平台）检Mtb/NTM及耐药突变；以逐步logistic回归建模型，ROC确定切点0.36，外部队列验证。
研究结果：
基线特征与队列分类：推导队列初筛215例，排除免疫抑制等38例，入177例（SNPT 69、非SNPT 108）；验证队列209例排32例，入177例（SNPT 67、非SNPT 110）。T-SPOT.TB在SNPT阳性率71.0% vs非SNPT 33.3%（OR 4.9），但ESAT-6/CFP-10斑点数在SNPT与LTBI间无差异，说明外周血T-SPOT.TB不能区分活动与潜伏。
BALF细胞因子浓度：SNPT患者BALF中IL-1β、IL-6、IFN-γ显著高于非SNPT，外周血无此差异；BALF/血IL-1β比值4.4、IL-6比值4.5，证实Mtb相关炎症因子在感染灶局部富集。
BALF淋巴细胞亚群：SNPT的BALF CD4+比例升高、CD8+降低，CD4/CD8比值升高（P<0.001），CD4+CD29+升高、CD8+CD28+降低；外周血无差异。CD4/CD8与CD4+CD29+正相关（rs=0.584）、与CD8+CD28+负相关（rs=?0.524）。
免疫模型构建：逐步回归保留BALF IL-1β、IL-6、CD4/CD8比值与T-SPOT.TB（量化ESAT-6/CFP-10 SFC）为独立预测因子，公式ln[P/(1–P)] = ?2.236 + 0.038×SFCESAT-6 + 0.033×SFCCFP-10 + 0.005×CIL-1β + 0.001×CIL-6 + 0.481×RCD4/CD8，推导队列AUC 0.856，切点0.36时灵敏73.9%、特异85.2%；培养阳与阴SNPT亚组AUC无差异（P=0.370）。
推导队列诊断价值：BALF tNGS灵敏58.0%、特异91.7%；模型并联tNGS后灵敏88.4%、特异79.2%，OR 29.0，漏诊率从42.0%降至11.6%；模型在T-SPOT.TB阳性者中区分SNPT与LTBI的OR 9.1。
外部验证：验证队列模型AUC 0.801，切点0.36灵敏71.6%、特异82.7%；T-SPOT.TB阳性者中区分SNPT/LTBI的OR 31.2；5例涂片阳性对照预测概率中位数0.99。tNGS单用特异90.7%灵敏65.7%；并联模型后灵敏94.0%、特异78.0%、OR 56.4、NPV 0.96，优于tNGS单用或tNGS+T-SPOT.TB并联。
讨论与结论翻译：研究人员在病灶靶向BALF中发现IL-1β、IL-6浓度与CD4/CD8 T细胞比值为SNPT独立局部免疫预测因子；整合外周血T-SPOT.TB（ESAT-6/CFP-10 SFC）的免疫模型可为临床疑似SNPT提供辅助诊断信息，与tNGS并联解读提升效能。外周血T-SPOT.TB不能区分活动PTB与LTBI，而BALF局部免疫谱更具判别力（推导队列OR 9.1，验证队列OR 31.2）。IL-1β反映巨噬细胞活化，IL-6参与炎症放大，CD4/CD8升高提示病灶CD4主导富集。模型在培养阳/阴SNPT中准确度一致（AUC均约0.80–0.875）。局限含观察性设计、非SNPT对照组异质、未校正多重比较、依赖支气管镜与足够BALF细胞数故限于已指征支气管镜的疑似病例、高流行区LTBI/NTM致敏可能偏移免疫本底。结论：BALF IL-1β、IL-6及CD4/CD8比值是SNPT独立预测因子；联合外周血T-SPOT.TB（ESAT-6/CFP-10）的模型可作为非HIV临床疑似SNPT的辅助诊断工具，促进抗Mtb治疗及时启动。
