生物打印核壳活体材料平台用于空间可控封装枯草芽孢杆菌及持续代谢物交换

《Bioactive Materials》：Bioprinted core-shell living material platform for spatially controlled encapsulation of Bacillus subtilis and sustained metabolite exchange

　　

抗菌素耐药性（AMR）已成为日益严峻的全球公共卫生危机，亟需替代策略以降低环境中耐药病原体的负荷。基于微生物的生物防控具有前景，但在实际场景中有效部署仍具挑战。研究人员提出一种3D生物打印核壳构建体，其具备可调纳米级孔隙度的聚乙二醇二丙烯酸酯（PEGDA）外壳，内部封装生物防控剂枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）TH035的可萌发孢子。该构型支持孢子长期存活，同时在4周内抵御紫外-C（UV-C）照射、乙醇暴露和干燥等常见环境应激。纳米多孔PEGDA外壳在实现有效细菌限域的同时，允许充足代谢物交换以支持B. subtilis萌发与生长，并将耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）生长抑制约一个数量级。该方法证明了将B. subtilis孢子嵌入工程化支架以实现延长竞争功能的可行性。基于数字光处理（DLP）的生物打印兼具灵活性与可扩展性，为定制设计与高通量制造提供潜力。该概念验证平台未来可应用于生物医学包装、环境卫生及建筑环境表面涂层等领域，尤其在间歇性水分或营养可用性能支持孢子萌发与生物防控活性的场景中。

研究背景与立项依据

抗菌素耐药性（AMR）对全球公共卫生构成持续增长威胁，其中耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）在医疗机构表面的接触传播尤为突出。传统化学消毒剂频繁使用可能加速建筑环境细菌耐药演化，而现有芽孢杆菌（Bacillus）孢子生物防控产品依赖反复涂抹，难以长期维持活性，且直接释放萌发菌存在环境扩散与抗性基因转移风险。已有活体材料研究多将孢子混入块体基质或采用琼脂糖水凝胶挤出打印，缺乏物理限域屏障或面临高温喷头损伤、基质不适用高接触场景等问题。为此，研究人员依托数字光处理（DLP）生物打印技术，构建具选择性通透与生物封闭双重功能的核壳活体材料，以枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）TH035孢子为模型，探索其在持续代谢交换下长效抑制MRSA的可行路径。该文发表于《Bioactive Materials》。

主要关键技术方法

研究人员采用自定义385 nm DLP生物打印机，以海藻酸甲基丙烯酰胺（AlgMA）水凝胶为核材封装B. subtilis TH035（pSC01-GFP）孢子，以聚乙二醇二丙烯酸酯（PEGDA₂₅₀）掺甲醇致孔剂构建纳米多孔壳层；通过扫描电镜（SEM）、共聚焦荧光（GFP/SYTOX? Orange双标）、菌落计数（CFU）、柠檬黄（tartrazine）扩散示踪量化壳层通透与限域；样本含孢子封装核壳构建体、无壳AlgMA核对照、游离孢子对照及空壳对照，菌株来源于Bacillus Genetic Stock Center（TH035）与ATCC（MRSA TCH1516），应激实验设UV-C、100%乙醇、干燥及4周重复暴露，抑菌实验在室温24 h共培养下评估MRSA扩增比。

研究结果

2.1 水凝胶核与孢子封装优化

研究人员比较PEGDA₇₀₀、透明质酸缩水甘油甲基丙烯酰胺（HAGM）与AlgMA三种DLP材料，以GFP荧光强度判定萌发效率，AlgMA边缘清晰度与活性最优，选定其为核材；光照强度在可打印阈值以上变化不影响力学与活性；AlgMA内菌落尺寸分布24 h呈双峰、随时间趋于均匀，支持至少96 h活性增殖。

2.2 核壳结构构建与代谢交换、细菌限域

PEGDA₂₅₀单独交联致密不通透，甲醇致孔剂浓度0–70%（v/v）使壳层纳米孔递增；70%甲醇条件下AlgMA核内孢子萌发为营养细胞并被限域于1 mm核区，萌发效率>99.9%，8 h达10⁶–10⁷ CFU/mL；无壳对照上清OD₆₀₀显著升高证实逃逸，核壳构建体8天OD₆₀₀近零；柠檬黄释放随致孔浓度上升而增加，证实小分子代谢物级扩散可行而营养细胞被截留。

2.3 结构参数对细菌团聚体形成的影响

DLP实现250 μm分辨率“活体瓷砖”与大区域棋盘掩模均布；核尺寸0.5/1/1.5 mm同面密度下团聚分布反向变化；壳厚1 mm内变化不影响生长；孢子浓度5×10⁶/5×10⁷/5×10⁸ mL^-1时低浓度促大团聚、高浓度成多数小团聚，符合群体感应或营养竞争解释。

2.4 封装B. subtilis对常见环境应激的耐受性

萌发前应激：干燥与UV-C对团聚尺寸分布无显著影响，乙醇使萌发后团聚变小；萌发后应激：UV-C下壳层藉米氏散射衰减保护营养细胞，干燥与乙醇致AlgMA基质重组使团聚偏大。4周重复暴露实验显示，短期各应激组CFU与对照无差；第4周时干燥、乙醇、UV-C组萌发后CFU分别较对照降低9.72、33.5、8.76倍，表明累积亚致死损伤主要在萌发外长阶段显现，但孢子可长期存活。

2.5 封装B. subtilis对MRSA的抑制活性保留

室温24 h共培养中，核壳封装孢子与游离孢子均使MRSA扩增比降至约0.31与0.49（空壳对照为1.00），即抑制约一个数量级，两组间无显著差异，证明纳米多孔壳不妨碍抗菌代谢物/营养竞争信号外传。

讨论与结论翻译

研究人员在讨论中指出，AMR仍是关键挑战，所开发DLP打印核壳结构以AlgMA核保活、甲醇致孔PEGDA壳实现“限域+选择性通透”单构体协同，超越既往块体混入或无通透调控的活体材料；250 μm分辨率与棋盘大面积图案化回应了挤出打印通量瓶颈；甲醇致孔虽具概念验证价值，毒性限制规模制造，未来需低毒致孔剂与孔径-传输定量映射；4周应激下结构完整、孢子存活，但重复乙醇暴露削弱萌发容量，需材料缓冲或菌株改造。抑菌机制未单解，可能为抗菌肽、群体感应干扰、营养夺获共同所致。结论部分重申：该平台证明B. subtilis TH035孢子可空间可控封装于PEGDA/AlgMA核壳中，在UV-C、乙醇、干燥下保活4周，经纳米孔持续交换代谢物抑制MRSA一个数量级，DLP生物打印赋予形状定制与高通量潜力，为生物医学包装、环境卫生涂层等间歇湿润场景提供概念验证。