CCL2/CCR2轴提示在肥胖相关脂肪组织炎症与弱精症中支持细胞损伤之间发挥桥接作用：整合多组学、机器学习及体外验证

《Biochemical and Biophysical Research Communications》：CCL2/CCR2 Axis Suggests a Role in Bridging Obesity-Related Adipose Inflammation to Sertoli Cell Injury in Asthenozoospermia: Integrated Multi-Omics, Machine Learning and In Vitro Validation

　　

# 摘要

本研究建立了一个整合框架，结合多组学分析、机器学习（ML）、单细胞RNA测序（scRNA-seq）、分子对接和体外验证，以探究肥胖相关弱精子症（AZS）的潜在机制和治疗靶点。基于基因表达综合数据库（GEO）中的转录组数据，差异表达分析和加权基因共表达网络分析（WGCNA）鉴定了37个候选基因，这些基因富集于细胞因子-细胞因子受体相互作用、肿瘤坏死因子（TNF）信号通路以及与趋化因子相关的炎症通路。蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）分析表明CTSS是核心基因。在12种算法的113个机器学习模型中，glmBoost+LDA表现最佳，并优先筛选出CCL2、CCL4、EDEM3、PHF3和SLC38A2作为核心生物标志物；Shapley加法解释（SHAP）评估了它们的预测贡献。基因集富集分析（GSEA）、免疫浸润和scRNA-seq分析发现脂肪组织巨噬细胞是Ccl2/CCL2的主要细胞来源。然而，由于scRNA-seq数据来源于小鼠脂肪组织而非人类睾丸，该发现主要服务于生成以下假设：巨噬细胞来源的CCL2/CCR2信号可能在理论上通过炎症放大和细胞间通讯，促发睾丸微环境破坏和支持细胞损伤，而非提供跨组织传递的直接体内证据。分子对接、细胞热漂移实验（CETSA）和TM4细胞实验表明，小檗碱可调控CCL2/CCR2轴并抑制MAPK/NF-κB信号通路，从而减轻炎症、凋亡和血睾屏障（BTB）损伤。总体而言，CCL2/CCR2轴被认为在肥胖相关的脂肪炎症和男性生殖功能障碍的背景下充当病理性桥梁，小檗碱显示出作为候选化合物的潜力，值得进一步的机制和转化研究。这些发现为未来体内研究提供了可检验的假设，以确定CCL2/CCR2轴在肥胖相关AZS中是否发挥因果作用。

# 引言

男性不育已成为全球生殖健康面临的重大挑战，其中弱精子症（AZS），其特征为前向运动精子比例<32%，占不育病例的40%至50%1'2'3。尽管AZS病因异质性明显，但越来越多的临床和实验证据表明，肥胖是精液质量下降和男性生殖功能障碍的独立危险因素?'?'?。虽然肥胖与精子数量减少以及少精症或无精症风险增加的关联更为一致，但证据也表明肥胖可能对前向和总精子运动性产生不利影响，尽管这一关联在不同人群中的一致性较差。因此，我们聚焦于肥胖相关AZS这一具体且具有临床意义的表型，以探究潜在的代谢和炎症机制，而非将AZS视为肥胖主要或唯一的生殖表现。然而，肥胖相关的代谢紊乱如何损害男性生殖功能并降低精子运动性仍不清楚。这是一个复杂的病理过程，涉及神经内分泌功能障碍、全身代谢紊乱和慢性低度炎症?'?'?。在这些因素中，脂肪组织炎症在近期研究中受到更多关注，它可能是全身代谢紊乱与生殖损伤之间的重要纽带。在肥胖状态下，附睾白色脂肪组织表现出明显的免疫变化，包括巨噬细胞浸润和持续性炎症激活。活化的巨噬细胞和脂肪细胞释放炎症介质和趋化因子，如CCL2。这些因素可能损害血睾屏障（BTB）完整性、影响支持细胞功能，并扰乱免疫保护的精子发生微环境?'?'?'1?。然而，将肥胖相关脂肪炎症与支持细胞损伤联系起来的关键分子仍然不清楚，其细胞来源和变化模式也尚不明确。

为弥补这些空白，我们采用了一种结合多队列转录组分析、机器学习（ML）、单细胞RNA测序（scRNA-seq）、分子对接和体外功能验证的研究框架，以鉴定潜在将肥胖相关全身改变与AZS联系起来的候选介质分子，并检验免疫和炎症信号在生殖损伤过程中如何将脂肪组织与睾丸联系起来11'12。我们通过差异表达分析、加权基因共表达网络分析（WGCNA）和基于机器学习的特征选择筛选了潜在将肥胖相关改变与AZS联系起来的候选基因。随后结合免疫细胞浸润分析和单细胞转录组特征鉴定，确定了关键介质的细胞来源并阐明这些细胞之间的通讯方式。除机制探索外，我们还旨在通过筛选药物-基因相互作用和识别候选治疗化合物来评估优先介质的转化潜力。随后使用分子对接、细胞热漂移实验（CETSA）和体外TM4支持细胞损伤模型来评估它们的潜在靶点结合能力和生物学效应。本研究的概念框架基于以下逻辑：肥胖被定位为"信号来源"——即全身炎症和代谢失调的驱动因素——而AZS被定位为"靶器官结局"——即局部睾丸损伤和精子功能障碍的效应表现。因此，肥胖和AZS数据集不被视为代表同一生物学状态，而是作为两个互补的分析维度：肥胖数据集用于捕获全身炎症信号，而AZS数据集用于鉴定与局部睾丸功能障碍相关的转录变化。这两个维度的交集旨在筛选可能介导脂肪组织到睾丸信号传递的候选介质基因。这种"跨器官介质模型"构成了我们研究的核心概念前提。总体而言，我们的研究提出了一个将肥胖与男性生殖障碍联系起来的多层次病理网络，重点突出了CCL2/CCR2轴作为值得进一步研究的优先候选靶点。这些发现为未来AZS的机制研究和诊断探索提供了理论基础和依据，而非作为临床转化的确证性证据。

# 方法片段

## 数据来源与预处理

从GEO数据库（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）下载了肥胖相关数据集（GSE24883、GSE44000、GSE151839）和AZS相关数据集（GSE160749、GSE22331、GSE34514）。具体而言，GSE24883包含8个肥胖和8个正常体重的皮下脂肪组织样本，GSE44000包含7个肥胖（BMI>30）和7个正常体重（BMI<25）的皮下脂肪组织样本。对于GSE151839，仅纳入20个脂肪组织样本（10个超重和10个正常体重样本），而皮肤

## 肥胖和AZS的数据整合与转录组特征分析

为描述肥胖和AZS的转录组特征，我们使用sva包中的ComBat方法整合数据集并校正批次效应。所有纳入数据集的临床特征汇总于补充表S1。PCA显示批次效应校正后样本分散度明显降低，样本主要按疾病状态聚类（图2A-B）。随后使用校正后的基因表达矩阵进行差异表达分析。

# 讨论

本研究使用了一个整合分析框架，结合多组学分析、机器学习、单细胞RNA测序、分子对接和体外验证，研究肥胖相关AZS的分子机制。通过多队列转录组整合和特征选择，鉴定了37个候选介质基因，并进一步筛选出五个核心生物标志物，包括CCL2、CCL4、EDEM3、PHF3和SLC38A2。在这些生物标志物中，CCL2在多项分析中显示一致的结果。

# 结论

总之，本研究提供了一个假设生成型整合框架，表明肥胖相关AZS涉及多层次病理网络，包括巨噬细胞激活、慢性低度炎症、内质网应激和代谢紊乱。在此背景下，我们的多组学相关性和体外数据共同将CCL2/CCR2信号轴优先确定为候选下游炎症通路。该通路可能参与脂肪

# CRediT作者贡献声明

**Teng Fei（滕飞）**：撰写—审阅与编辑、可视化、验证、调查、数据管理。
**Tong Siyu（佟思羽）**：撰写—审阅与编辑、验证、方法学、调查。
**Li Haixin（李海新）**：资源、调查、数据管理。
**Wang Dingkun（王定坤）**：撰写—审阅与编辑、监督、经费获取。
**Bai Fangfang（白芳芳）**：撰写—审阅与编辑、监督、经费获取。
**Wang Pengrui（王鹏瑞）**：撰写—审阅与编辑、撰写—初稿、软件、方法学、形式分析。

# 未引用参考文献

47.

# 利益冲突声明

作者声明，本研究是在不存在任何可能被视为潜在利益冲突的商业或财务关系的情况下进行的。

# 伦理批准与参与同意

根据《涉及人的生命科学和医学研究伦理审查办法》（2023年2月18日发布，中国），本研究涉及公开数据，符合伦理豁免标准。本研究不涉及人类参与者、人类组织样本或活体动物。所有分析均基于公开数据集和商业获取的细胞系。因此，不需要伦理批准和知情同意。

# 临床试验编号

不适用。

# 数据可用性声明

本研究分析的所有GEO数据集均可从基因表达综合数据库（GEO）公开获取。本研究使用的GEO数据集包括：肥胖相关数据集GSE24883、GSE44000和GSE151839；弱精子症相关数据集GSE160749、GSE22331和GSE34514；外部验证数据集GSE88837和跨组织稳健性数据集GSE69039；以及单细胞RNA测序数据集GSE248440。当前研究期间生成和/或分析的数据集

# 生成式人工智能及AI辅助技术在写作过程中的声明

在准备本工作期间，作者使用了ChatGPT来改善语言表达。使用该工具后，作者对内容进行了审阅和编辑，并对出版物的内容承担全部责任。

# 资助信息

本研究由国家自然科学基金委员会资助（编号：82274470）。

# 利益冲突声明

? 作者声明，他们没有任何已知的竞争经济利益或个人关系可能影响本文所报告的工作。

# 致谢

我们衷心感谢国家自然科学基金委员会提供的资金支持（编号：82274470）。

# 缩略语

| 缩略语 | 英文全称 | 中文名称 |
|---|---|---|
| AZS | Asthenozoospermia | 弱精子症 |
| ML | Machine Learning | 机器学习 |
| GEO | Gene Expression Omnibus | 基因表达综合数据库 |
| WGCNA | Weighted Gene Co-expression Network Analysis | 加权基因共表达网络分析 |
| GO | Gene Ontology | 基因本体 |
| KEGG | Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes | 京都基因与基因组百科全书 |
| TNF | Tumor Necrosis Factor | 肿瘤坏死因子 |
| PPI | Protein-Protein Interaction | 蛋白质-蛋白质相互作用 |
| CTSS | Cathepsin S | 组织蛋白酶S |
| SHAP | Shapley Additive Explanations | Shapley加法解释 |
| GSEA | Gene Set Enrichment Analysis | 基因集富集分析 |
| HFD | High-Fat Diet | 高脂饮食 |
| LFD | Low-Fat Diet | 低脂饮食 |
| DEGs | Differentially Expressed Genes | 差异表达基因 |
| TOM | Topological Overlap Matrix | 拓扑重叠矩阵 |
| GS | Gene Significance | 基因显著性 |
| MM | Module Membership | 模块成员度 |
| BP | Biological Processes | 生物过程 |
| CC | Cellular Components | 细胞组分 |
| MF | Molecular Function | 分子功能 |

王鹏瑞 | 滕飞 | 佟思羽 | 李海新 | 王定坤 | 白芳芳

北京中医药大学第三附属医院，中国北京，100029