《Forests》：Development of an In Vitro Pathogenicity Test for Phytophthora cinnamomi for Screening Quercus suber Genotypes
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栎树枯萎病是伊比利亚半岛及地中海盆地严重的环境与经济问题，主要致因是卵菌恶疫霉（Phytophthora cinnamomi Rands）侵染。为支撑育种与选种计划，亟需可靠快速的寄主感病性评估方法。本研究开发并评价了一种利用菌丝悬液与游动孢子（zoospor
栎树枯萎病是伊比利亚半岛及地中海盆地严重的环境与经济问题，主要致因是卵菌恶疫霉（Phytophthora cinnamomi Rands）侵染。为支撑育种与选种计划，亟需可靠快速的寄主感病性评估方法。本研究开发并评价了一种利用菌丝悬液与游动孢子（zoospore）两种接种方式筛选栓皮栎（Quercus suber L.）基因型抗性的体外致病力测定体系。研究人员评估了接种体类型与剂量、症状发展、病原定殖及病害进程，并检验了该体系区分寄主基因型的能力。两种接种方式均稳定诱导侵染，产生典型根坏死，继而地上部症状与植株死亡。游动孢子接种后2天内可见根坏死，表面消毒根系的成功再分离证实24小时内即发生组织定殖。观察表明存活时间与根坏死长度是病害进程的有效指标。基因型相关差异体现在时间变量上：菌丝悬液测定中首症时间（T1S）与全坏死时间（TCN）有差异，游动孢子测定中存活时间有差异；而早期根坏死与生长变量在测试基因型间无显著差异。综上，结果支持所提体外规程作为评估栓皮栎对P. cinnamomi响应的短期初筛方法，补充温室与田间评价。
研究背景方面，栎树（Quercus）枯萎病在伊比利亚半岛与地中海盆地造成环境与经济损失，恶疫霉（Phytophthora cinnamomi）为主因卵菌，经自由水传播，引起细根坏死、黄化与冠层枯死。视觉症状虽最易量化，但田间与温室评价耗时长。体外培养系统可安全、快速、低成本测试寄主感病性，然而针对栓皮栎（Quercus suber L.）这一西地中海生态与经济利益核心树种的特异性规程尚未建立，且其他宿主的体外方法不能直接套用。因此研究人员旨在开发栓皮栎体外致病力测定，评价菌丝悬液与游动孢子悬液接种效力、剂量、时序、症状动态及进展变量，以服务遗传改良与无性系筛选。论文发表于《Forests》。
主要关键技术方法上，研究人员以体外节点培养生根的栓皮栎无性系（clone）试管苗为材料，无性系源自西班牙Huelva及葡萄牙Alto Alentejo、Algarve产地既往按子代耐受性分级（高度耐受、耐受、中等耐受、感病、高感）筛选的存活个体，包括HEE6、SAA361、COA47、SALG297、C4、BAA24等。病原采用三株已知毒力P. cinnamomi菌株（PC1、PC2、PC3）在澄清V8液体培养基扩繁。设两套接种：菌丝悬液法将苗移入蛭石（vermiculite）+半量MS液（MSV）体系，浇施35 mL悬液，剂量D1（60 μL L?1）与D2（60 mL L?1，约1×104 CFU/单位）；游动孢子法将苗置5 mL小瓶加1 mL 106 zoospores mL?1悬液，暗2天光2天后转蛭石。病害变量含首症时间（T1S）、基质满被菌丝时间（TCM）、全坏死时间（TCN）、存活时间、根坏死长度（NLR）、根长（RL）等；病原定殖用表面消毒根段在NARPH-V8选择培养基再分离验证；游动孢子密度用Neubauer计数室追踪；统计采用生存分析（life table、Kaplan–Meier）、ANOVA与重复测量ANOVA。
研究结果部分，3.1菌丝悬液法下，3.1.1剂量试验中D2较D1加速基质定殖与症状出现（p=0.011），17天末15/24接种苗全坏死，对照不进展；初步剂量试验克隆间无显著差异。3.1.2健康与生长测定以COA47单克隆D2显示，14 dpi接种组视觉健康（VH）劣化（p<0.001），茎径（Ds）下降，根坏死长度（NLR）组间差异极显著（p<0.001）且NLR/RL累积上升，对照无坏死；五克隆比较中T1S（p=0.028）与TCN（p=0.005）克隆间差异显著，HEE6与C4首症晚、全坏死慢，COA47与SALG297快，BAA24居中，TCM无差异。3.1.3再分离从接种苗根、茎、叶选出P. cinnamomi，对照阴性。3.2游动孢子法中，3.2.1诱导峰值在18℃净水2小时（1.81×106 zoospores mL?1），6小时游动率降至2.8%；3.2.2接种后6小时游动率11.1%，24小时为0。3.2.3根段再分离24小时阳性、6小时阴性，证24小时已内侵。3.2.4两克隆（BAA24、SALG297）三菌株下，2 dpi见根坏死，4 dpi坏死斑达17.4±4.6个、坏死长27.1±7.1 mm，占根长52.9%–62.1%；早期坏死与生长变量克隆间不显著，但存活时间克隆间极显著（p<0.001），SALG297均活8.36天、BAA24活11.62天，菌株间不显著。3.3蛭石浸出液游动孢子密度两法均呈5–6天周期峰值，仅第0与16天法间差异显著。
讨论与结论翻译部分，研究人员指出两套规程均能在短期诱导侵染并追踪进展，菌丝悬液较易制备稳定，游动孢子可精确标准化初始侵染体数且主动趋根；D2约104 CFU/单位虽低于温室用量仍足速发疫病，千倍剂量差仅在早期加速症状，后期因病原产次生游动孢子而收敛。根坏死长度为直接可量化指标，时间变量（T1S、TCN、存活时间）比早期生长或坏死量更能分基因型，结果与León-Sánchez等子代分级定性相容但未作克隆级验证；无克隆×菌株互作，未来需多分离物面板。体外全程约60天（生根25–30天+硬化15天+接种后15天），远短于田间数月，可作P. cinnamomi响应初筛补充温室与田间。结论上，所建菌丝悬液与游动孢子体外致病力测定能稳定复现栓皮栎根坏死至全株死亡进程，时间型变量可有效区分中等耐受以上无性系，支持作为遗传选育短期预筛工具。
