肌萎缩侧索硬化症 (ALS) 是一种进行性且致命的神经退行性疾病，其特征是上下运动神经元的退化，最终导致肌肉无力、瘫痪和呼吸衰竭 [1], [2]。尽管经过数十年的研究，疾病修饰治疗选择仍然极其有限。利鲁唑和依达拉奉仅提供适度的生存或功能益处，并不能阻止疾病进展 [3], [4], [5], [6], [7], [8]。最近，反义寡核苷酸 (ASO) 疗法作为一种针对遗传定义 ALS 亚型的精准医疗策略脱颖而出，例如针对 SOD1 相关 ALS 的 Tofersen [9], [10], [11], [12], [13]。然而，这些方法仅适用于一小部分患者。值得注意的是，2024 年 III 期 PHOENIX 试验失败后 AMX0035 (Relyvrio) 的撤市进一步突显了有前景的临床试验前发现与稳健的临床疗效之间持续的差距 [14], [15]。综上所述，这些局限性突显了对具有改善预测能力的生理学相关人类疾病模型的迫切需求，以用于 ALS 药物开发。
越来越多的证据表明，ALS 不仅仅是一种细胞自主的运动神经元疾病，而是涉及神经肌肉接头 (NMJ) 的早期和进行性功能失调，这通常先于明显的运动神经元丢失 [2], [16], [17]。作为运动神经元和骨骼肌之间的关键突触界面，NMJ 的不稳定日益被视为疾病发起和进展的关键贡献者。然而，大多数现有的体外 ALS 模型依赖于二维 (2D) 神经肌肉培养，无法重现天然 NMJ 的三维架构、力学微环境和空间组织。这些简化的系统通常表现出未成熟的突触表型、由于肌肉收缩导致的细胞快速脱落以及培养寿命有限，从而限制了长期功能分析和治疗功效的可靠评估 [18], [19]。这些局限性可能部分导致了体外药物反应与临床结果之间的频繁差异，例如利鲁唑在简化的体外模型中显示出明显的神经保护作用，但在患者中仅有益处微小 [3], [4], [5]。
为了解决这些挑战，三维 (3D) 神经肌肉模型和神经肌肉类器官因其对 NMJ 成熟、功能稳定性和生理学相关细胞间相互作用的改善支持而受到越来越多的关注 [19], [20], [21], [22]。这些平台中许多依赖于基质胶 (Matrigel) 基质或微流控设备。虽然基质胶实现了人类 NMJ 建模的标志性进展，但长期培养持续时间，加上其未定义的成分和批次间变异，限制了可重复性和定量控制 [23], [24], [25], [26]。微流控方法提供了精确的空间区室化，并能够实现受控的神经肌肉共培养；然而，其技术复杂性、低通量和有限的可扩展性对药物筛选应用中的广泛采用构成了挑战 [27], [28], [29]。因此，仍然迫切需要一种通用的、可重复的且在架构和力学上可调的生物材料平台，能够支持长期、功能性的人类 NMJ 建模。
甲基丙烯酰化明胶 (GelMA) 水凝胶作为一种有前景的替代细胞外基质 (ECM) 模拟材料脱颖而出，这得益于其确定的化学成分、优异的生物相容性、光学透明性和光交联特性 [30], [31], [32]。重要的是，GelMA 水凝胶的力学性能可以通过调节紫外线照射和交联条件精确调节，从而创建针对不同细胞功能的微环境 [33], [34]。此外，GelMA 水凝胶支持高分辨率微图案化，促进营养和氧气扩散，并与先进成像技术兼容，使其特别适用于复杂的 3D 组织模型 [30], [35]。
在本研究中，我们开发了一种六边形微图案 GelMA 水凝胶，旨在通过在一个构建体内容纳肌肉和运动神经元谱系的不同微环境需求，实现时空仿生的神经肌肉共培养。六边形微图案是基于我们之前的图案优化研究选择的，在该研究中系统比较了块状、线图案化和六边形图案化水凝胶构建体 [36]。在这些配置中，六边形几何形状在结构稳定性、互连孔隙架构、分子扩散和嵌入细胞行为之间提供了有利的平衡。在本研究中，这种之前优化的几何形状被进一步调整，以生成用于运动神经元球定位的微孔状区室、用于神经突延伸和营养运输的互连通道，以及用于成肌成熟和血管形成的充足结构支持。尽管之前已经探索过 GelMA 光调谐和图案化水凝胶构建体，但本研究的显著性在于将紫外线可编程的架构 - 力学水凝胶设计与体内血管化分析以及区室化人 iPSC 来源的 ALS 神经肌肉疾病建模相结合。而不是将两种细胞类型嵌入均匀的 3D 基质中，hiPSC 来源的成肌细胞在周围的 GelMA 网络中得到支持以进行成肌分化，而运动神经元球最初被定位在定义的六边形微孔中，以建立允许性的神经元生态位。这种架构旨在模拟体内 NMJ 发育的关键步骤，其中运动轴突向预组织的肌纤维延伸，并促进神经突通过水凝胶进入以实现突触耦合。重要的是，GelMA 水凝胶提供光学透明度和光可调交联，允许紫外线照射协调构建体微架构和有效力学性能，使得相同的材料平台可以优化用于结构支持的肌管对齐、NMJ 样组织和血管长入。综上所述，这种结构上和力学上适应性的水凝胶框架提供了一个快速建立、可重复且可扩展的区室化人类 NMJ 模型，用于研究 ALS 相关的神经肌肉功能障碍和评估候选药物。
