《Biomaterials Advances》：Hydrogen bond-organized β-sheet self-assembling peptide hydrogel integrating rapid hemostasis and wound repair
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•超短肽系统中的集成止血与伤口修复。•P3 (PYFKWS) 在生理相关的 PBS 和血液条件下迅速形成非流动水凝胶，能够实现有效的物理封闭、红细胞吸附和血小板募集。P3 的血液凝固指数达到 4.68%，并显著缩短了小鼠尾部截断和大鼠肝损伤模型中的止血时间和血液流失量。除了止
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超短肽系统中的集成止血与伤口修复。
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P3 (PYFKWS) 在生理相关的 PBS 和血液条件下迅速形成非流动水凝胶，能够实现有效的物理封闭、红细胞吸附和血小板募集。P3 的血液凝固指数达到 4.68%，并显著缩短了小鼠尾部截断和大鼠肝损伤模型中的止血时间和血液流失量。除了止血外，P3 减轻了细胞内氧化应激，降低了促炎细胞因子水平，调节了与巨噬细胞相关的伤口微环境，并促进了组织再生。
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最小六残基序列优化提供了合成简洁的设计。
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对 P1、P2 和 P3 的系统比较确定了 P3 为优化的六残基肽，其中赖氨酸和苯丙氨酸的最小位置重排改善了与 β-折叠相关的组装和整体生物性能。紧凑的序列简化了与较长自组装肽系统相比的肽合成，并为开发多功能肽基止血材料提供了实用的分子框架。
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氢键组织建立了止血的构效关系。
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结合 CD、FT-IR、流变学和分子动力学分析表明，尽管 P3 的总氢键数量少于 P2，但 P3 具有最高的 β-折叠含量和更大的分子间氢键贡献。这种有利的分子间组织支持了快速的凝胶形成和连续的水凝胶网络发育，而由此产生的网络促进了红细胞的滞留和血小板的黏附。这些发现表明，止血性能是由协调的 β-折叠组织、分子间相互作用、网络特性和血液成分募集决定的，而不仅仅是由氢键数量决定的。
引言
创伤性出血对生命构成严重威胁，如果没有快速的止血和伤口愈合，可能会致命，而快速止血和伤口愈合对于降低死亡率至关重要 [1], [2]。止血材料的临床有效性不仅取决于凝血的快速启动，还取决于其调节伤口微环境以促进组织再生的能力。然而，许多现有的止血材料主要通过物理封闭、吸收或凝血激活来优化快速止血，而它们调节氧化应激和炎症反应的内在能力仍然有限。此外，出血后微环境的调节不足可能会损害组织修复，而材料保留时间过长可能会引起不良的异物反应。尽管已有报道水凝胶材料用于伤口止血和愈合促进，但其进一步发展往往受到复杂制备策略、依赖外部交联剂以及需要额外功能组分的限制 [3], [4]。
自组装肽水凝胶代表了该领域的突破。它们的自发凝胶化由内在的 β-折叠形成驱动，消除了对外源交联剂的需求，而其完全生物衍生的成分显著降低了免疫原性 [5], [6], [7], [8]。这种方法促进了各种肽基止血系统的开发。代表性例子包括 SLac (KSLSLSLRGSLSLSLKGRGDS, 21 aa)，它形成纳米纤维水凝胶屏障以实现快速止血 [9]；PFV (CFLIVIGSIIVPGDGVPGDG, 20 aa)，它被纳入蓝光触发的 GelMA 复合水凝胶中以控制胃肠道出血 [10]；以及超短肽 I3QGK (6 aa)，其转谷氨酰胺酶响应性凝胶化促进血液凝胶化和血小板黏附 [11]。这些研究证明了肽自组装用于出血控制的可行性，尽管它们不同的激活机制、配方和出血模型使得直接的跨研究性能排名不合适。更重要的是，大多数报道的系统主要关注急性止血，而随后的氧化和炎症伤口微环境的内在调节仍未得到充分探索。止血后，维持氧化还原平衡和防止过度炎症成为有效组织修复的关键 [12], [13], [14]。尽管抗菌或额外功能化的肽水凝胶可能会改善伤口环境 [15], [16]，但在简单的短肽系统中整合直接的自由基清除活性、快速止血和持续修复支持功能仍然具有挑战性。因此，开发结合快速原位止血与内在抗氧化和伤口愈合活性的自组装肽水凝胶代表了一个重要的研究方向 [17], [18], [19], [20], [21], [22], [23], [24]。
利用肽两亲性驱动的自组装 [25], [26] 和内在抗氧化氨基酸基序 [27], [28]，本研究设计了一个聚焦的三短肽系列。肽通过基于 Fmoc 的固相肽合成合成，其中链延长从树脂上的 C 端到 N 端进行；在整个手稿中，所有肽序列均按惯例从 N 端到 C 端展示。基于凝血性能和血细胞相互作用的初步筛选鉴定了形成水凝胶的肽 P1 (PYKFW)，作为后续优化的基础。为了提高亲水性，在 P1 的 C 端引入丝氨酸残基生成 P2 (PYKFWS)，它在保留止血活性的同时表现出改善的水分散性。进一步的位置交换赖氨酸和苯丙氨酸得到 P3 (PYFKWS)，具有更平衡的亲水性和疏水残基的空间分布。全面的结构和计算分析表明，P3 表现出最高的 β-折叠含量和比 P2 更大的分子间氢键网络贡献，尽管总氢键数量较少，这表明氢键组织，而不仅仅是氢键数量，有助于肽组装和功能性能。体内研究使用小鼠尾部截断和大鼠肝损伤模型表明，P3 实现了有效的出血控制，与对照组相比显著减少了止血时间和血液流失量。进一步的研究表明，P3 通过调节与氧化应激相关的伤口微环境，降低了促炎细胞因子水平 (TNF-α: ↓63.2%; IL-6: ↓58.7% vs control)，从而在全层皮肤缺损模型中促进伤口修复。总之，这些发现表明，超短自组装肽可以将快速止血与抗氧化和伤口愈合活性相结合，为开发多功能肽基止血材料提供了一种简单的策略。为了进一步将本肽系统定位在当前自组装肽基止血材料的格局中，表 1 总结了代表性系统。
章节摘要
材料
Fmoc-Trp(Boc)-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-L-Lys(Boc)-OH, 和 Fmoc-Tyr(tBu)-OH, 以及 Tyrode's 溶液，购自上海阿迈科生物科技有限公司。1H-Benzotriazol-1-yloxytripyrrolidinophosphonium hexafluorophosphate (PyBop), 三氟乙酸 (TFA), N,N-二异丙基乙胺 (DIEA), 1-羟基苯并三唑 (HOBt), ABTS (2,2′-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)), 和 DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) 购自上海麦克林
肽结构表征
通过采用血栓动力学分析和血细胞界面调节测定的筛选策略 (图 1a)，我们鉴定了一种具有显著促凝血活性的自组装水凝胶肽 P1 (PYKFW)。鉴于 P1 含有高比例的疏水残基，导致一定的疏水性和浓度依赖的自组装行为，我们在其 C 端引入亲水丝氨酸残基以增强水溶性，同时保留其自组装
结论
总之，我们设计并系统评估了三种超短自组装肽，P1 (PYKFW), P2 (PYKFWS), 和 P3 (PYFKWS)，以研究最小序列变化如何影响肽组装、水凝胶形成和生物性能。所有三种肽均表现出与 β-折叠相关的自组装，并在生理条件下形成纳米纤维水凝胶。其中，P3 表现出优化的超分子组织，其特征是更有利的
CRediT 作者贡献声明
李妍然: 写作 – 审阅与编辑，写作 – 原稿，形式分析，数据整理。 向凯: 形式分析，数据整理。 马军: 数据整理。 王庆熬: 数据整理。 郝三伟: 数据整理。 王芳庆: 数据整理。 杨格: 数据整理。 李德刚: 软件，数据整理。 丛海林: 写作 – 审阅与编辑，写作 – 原稿，可视化，验证，监督，软件，项目管理，方法论，研究，资金获取，
致谢
本研究得到了 国家重点研发计划 (2024YFE0104100)、 国家自然科学基金 (22274083, 22574089)、 山东省自然科学基金 (ZR2022LZY022, ZR2023LZY005)、 青岛市科技惠民示范工程 (26-1-5-cspz-23-nsh)、 青岛市南区科技计划项目 (2022-4-005-YY) 和 国家重点...探索项目 的支持
李妍然 | 向凯 | 马军 | 王庆熬 | 郝三伟 | 王芳庆 | 杨格 | 李德刚 | 丛海林 | 余冰
