基于壳聚糖固定化酶和RGB分析的纸基比色法用于葡萄糖、胆固醇和多巴胺定量

《Eng》：Paper-Based Colorimetric Assays Using Chitosan-Immobilized Enzymes and RGB Analysis for Glucose, Cholesterol, and Dopamine Quantification

　　

纸基比色测定提供了一种低复杂性的策略，可将酶促反应转化为可测量的光学响应。本研究分别评估了固定于壳聚糖大球上的葡萄糖氧化酶（glucose oxidase, GOx）、胆固醇氧化酶（cholesterol oxidase, ChOx）和单胺氧化酶A（monoamine oxidase A, MAO-A）用于葡萄糖、胆固醇和多巴胺的单独比色测定。GOx、ChOx和MAO-A的固定化效率分别为79%、70%和70%，其中GOx和ChOx的饱和时间为20 min，MAO-A为10 min。在受控实验室条件下，酶促反应产生了浓度依赖性的显色响应。颜色测量在标准化仪器条件下进行，并以CIE XYZ三刺激值坐标表示，采用相对于相应空白的欧几里得距离作为分析响应。葡萄糖在评估的校准范围内呈现近似线性响应，而胆固醇则表现出非线性饱和行为，并使用指数饱和模型进行描述。对于多巴胺，定量线性校准被限制在低浓度区域，并使用非空白标准品。葡萄糖的检出限（limit of detection, LOD）为32.01 mg/dL，胆固醇为1.62 mg/dL，多巴胺为0.00047 μg/mL，对应定量限（limit of quantification, LOQ）分别为96.99 mg/dL、4.91 mg/dL和0.00142 μg/mL。结果表明，在受控实验室条件下，将壳聚糖固定化酶、纸基显色反应和定量颜色分析相结合用于单独测定葡萄糖、胆固醇和多巴胺是可行的。此外，还提出了一种纸基微流控架构，作为未来集成这些单独表征测定的概念验证。

该研究发表于《Eng》期刊，围绕纸基比色传感平台开发了葡萄糖、胆固醇和多巴胺三种生物标志物的单独测定方法，旨在为未来多参数集成分析奠定基础。

**研究背景与问题意识**

生物传感器通过将生物相互作用和生化反应转化为可定量的分析信号，在生物医学、环境和食品分析中应用广泛。葡萄糖是糖代谢的基本指标，其监测对代谢紊乱的评估至关重要；胆固醇参与细胞稳态和多种代谢过程，其水平异常与心血管及代谢疾病相关；多巴胺是与动机、学习、奖赏加工有关的神经递质，其信号异常涉及多种神经和行为疾病。这三类分子在奖励缺陷综合征（Reward Deficiency Syndrome, RDS）框架下具有特殊关联：多巴胺能功能低下可能促使个体寻求高糖高脂食物，进而影响代谢，因此联合检测这些指标有助于研究神经化学和代谢的相互作用。虽然电化学、纳米材料等检测策略具有高灵敏度，但往往需要专门材料和复杂仪器。纸基分析装置（paper-based analytical devices）因制作简便、试剂消耗低、可借助毛细作用引导液体而受到重视；比色检测可将化学反应转为颜色变化，但肉眼判读存在主观性。酶固定化技术能提高酶的稳定性和可操作性，壳聚糖因其生物相容性和丰富的氨基、羟基而成为合适载体。然而，从单测定走向集成平台需要先对每个组分进行充分表征，因此本研究先以壳聚糖大球固定化三种氧化酶，分别验证纸基比色测定的可行性。

**研究内容与总体结论**

研究人员采用沉淀法制备壳聚糖大球并以戊二醛交联，将葡萄糖氧化酶（GOx）、胆固醇氧化酶（ChOx）和单胺氧化酶A（MAO-A）分别固定于大球上。通过生化测试比较游离酶和固定化酶的活性，测定固定化效率、饱和时间以及pH和温度对酶活性的影响。随后在纸基上利用酶促反应产生过氧化氢，在辣根过氧化物酶（HRP）和邻联茴香胺存在下生成橙红色产物；使用便携式色度计在标准条件下测量颜色，将RGB值转换为CIE XYZ坐标，并以相对空白的欧几里得距离作为定量分析信号。结果表明，三种酶均能有效固定，GOx、ChOx和MAO-A的固定化效率分别为79%、70%和70%，饱和时间分别为20 min、20 min和10 min；固定化酶在接近生理条件的pH和温度范围内保留了足够的催化活性。葡萄糖在100–300 mg/dL范围内呈现近似线性响应，胆固醇呈非线性饱和行为，而多巴胺的线性响应仅限于低浓度区。该研究证实了纸基比色与定量颜色分析结合用于单独测定三种分析物的可行性，并提出了一个星形纸基微流控原型作为未来多通道集成的概念验证。

**关键技术方法**

主要技术包括：以沉淀法制备壳聚糖大球并用戊二醛交联；通过Lowry法测定酶固定化效率；利用紫外-可见分光光度法在500 nm处测定游离和固定化酶的活性，并对pH（5.0–9.0）和温度（15–65 °C）进行表征；纸基显色反应以邻联茴香胺和HRP作为显色体系；颜色采集使用PCE-XXM 30便携式色度计（D/8光学几何、包含镜面反射、D65标准光源、CIE 10°标准观察者、400–700 nm LED），测量时将孔径完全覆盖传感区域；通过公式将RGB转换为CIE XYZ坐标，计算相对空白的欧几里得距离作为分析响应；分别采用线性回归和指数饱和模型进行校准，并以3.3σ/m和10σ/m估算检出限与定量限。研究中所有分析均基于标准溶液，未涉及临床样本队列。

**研究结果**

**生化测试**
GOx固定后最适pH从约5.5移至5.8–6.0，最大活性升高18.19%，温度最适约40 °C；ChOx在pH 7.5和35 °C下达最大活性，固定后活性提高5.8%；MAO-A在pH 7.0–7.5保留游离酶97–99%的活性，固定化最小程度影响其性能。固定化动力学显示，GOx在20 min内达到79%偶联，ChOx在20 min内达到70%，MAO-A在10 min内达到70%，均呈现先快速结合后平台期的特征。

**pH和温度对游离和固定化酶的影响**
在pH 6.5和7.5下，GOx固定后活性分别下降约15%和5%，但残余活性仍高于45%；ChOx固定后活性反而增加约15%和5%，说明壳聚糖微环境有利于其结构稳定；MAO-A在pH 6.5损失约25–30%活性，但在 pH 7.5接近游离酶。在25 °C下，GOx相对活性损失仅2–7%，ChOx增加约5%，MAO-A损失15–20%。总体上，壳聚糖固定化对不同酶的影响具有酶依赖性，但均保留了适合传感应用的残余活性。

**比色检测**
纸基上，葡萄糖、胆固醇和多巴胺分别经对应酶氧化生成H₂O₂，再与HRP和邻联茴香胺反应产生橙红色产物，颜色强度随浓度增加而加深；多巴胺显色较浅，但可被仪器检测到。RGB分析中，三个颜色通道的值随浓度升高而下降，红通道占主导；CIE XYZ坐标显示颜色由浅色调向更深橙红色调移动。欧几里得距离随浓度呈单调增加，表明其可作为统一的定量响应变量。

**葡萄糖定量**
在100–300 mg/dL范围内，欧几里得距离与葡萄糖浓度呈强正线性相关，回归方程为y = 0.2866x ? 1.9113，决定系数R² = 0.9655；结合空白标准偏差（2.78）和斜率，得到LOD为32.01 mg/dL，LOQ为96.99 mg/dL。

**胆固醇定量**
胆固醇在25–500 mg/dL范围内呈现饱和型非线性响应，数据经非线性最小二乘拟合采用指数饱和模型D = a(1 ? exp(?kC))，无需剔除浓度点。由于响应非线性，LOD和LOQ先在响应域计算临界信号，再通过拟合方程的逆函数转换为浓度；空白标准偏差为0.40，计算得到LOD为1.62 mg/dL，LOQ为4.91 mg/dL，两者均低于实验最低非零浓度25 mg/dL，属于基于模型统计的估计值。

**多巴胺定量**
多巴胺在完整浓度范围（0–10 μg/mL）内呈非线性，但低浓度区（0.0015–0.01 μg/mL）表现出近似线性，线性回归方程为y = 4504.62x + 6.7263，R² = 0.9702。空白未纳入回归，仅用于背景表征和限值计算；空白标准偏差为0.64，LOD为0.00047 μg/mL，LOQ为0.00142 μg/mL，定量下限低于最低非空白标准品，体现该体系对多巴胺的高度灵敏度。

**提出的纸基微流控多传感器架构**
研究人员设计并制备了星形多层纸基微流控原型，包含上层疏水层、图案化聚合物层、纤维素纸流体层和下层疏水层，旨在通过毛细流将单个样本分配到多个独立传感区，用于同时检测葡萄糖、胆固醇、多巴胺和pH。该原型作为概念验证，尚未开展流动力学、通道优化和器件重复性的系统评价。

**讨论与结论**

讨论部分指出，与需要电极或纳米材料的电化学、纳米等离激元传感器相比，本研究提出的平台以简单性、低成本和多参数兼容性为设计重心；通过数字颜色量化避免了视觉判读的主观性，且允许不同分析物采用不同校准模型。当前工作为准确定量三种与RDS相关的生物标志物提供了可行的比色基础。但研究者也承认，该平台尚未在复杂生物基质中验证，未评估抗坏血酸、尿酸等内源性还原物质对过氧化物酶显色系统的潜在干扰，也未检测长期储存稳定性和批次间重现性；后续需开展干扰研究、回收率实验和生物样本验证。结论部分翻译如下：从技术角度看，本研究结果代表了对传感概念的初始验证，为发展更高集成度的纸基分析装置奠定了基础。所提出的微流控架构是将单独表征的传感区并入共同平台的第一步，未来对流体分布、同时运行、重现性和信号采集的优化有望实现更高水平的系统集成。本工作为结合可获得材料、定量颜色测量及未来紧凑型分析平台的纸基酶传感体系提供了功能起点，并推动其向分散化检测和实际应用方向发展。