《Livers》：Modeling Hepatic Ischemia–Reperfusion Injury: From 2D and Animal Models to Advanced 3D Platforms
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肝脏缺血-再灌注损伤（hepatic ischemia–reperfusion injury, IRI）是肝脏外科和移植领域面临的主要临床挑战，与术后并发症和移植物功能障碍密切相关。肝脏IRI的发病机制复杂且涉及多因素，包括缺血引起的代谢后果、氧化应激、炎症反
肝脏缺血-再灌注损伤（hepatic ischemia–reperfusion injury, IRI）是肝脏外科和移植领域面临的主要临床挑战，与术后并发症和移植物功能障碍密切相关。肝脏IRI的发病机制复杂且涉及多因素，包括缺血引起的代谢后果、氧化应激、炎症反应、内皮功能障碍以及再灌注时免疫通路的激活。尽管已有大量研究投入，临床前研究发现向有效临床干预措施的转化仍然有限。本综述对用于研究肝脏IRI的主要模型进行了批判性概述。常规二维体外系统，包括单一培养和共培养模型，为机制研究和高效筛选提供了受控环境，但无法完全再现肝脏微环境的结构和细胞复杂性。动物模型，尤其是基于小鼠、大鼠和猪的模型，对于研究肝脏IRI的系统性和多细胞方面仍然不可或缺。然而，物种特异性生理差异、伦理问题、高成本和有限的转化预测性构成了显著局限。在此背景下，三维肝脏模型已成为有前景的替代方案，能够弥合体外系统与动物实验之间的差距。通过更准确地再现组织结构、细胞间相互作用和功能异质性，三维平台提供了增强的生理相关性和转化潜力。研究人员讨论了每种实验方法的优势和局限性，并强调了先进三维模型作为互补工具的作用，这些工具可能有助于更精确地研究肝脏IRI并加速有效治疗策略的开发。
3. 肝脏IRI的病理生理学
肝脏IRI是一个复杂的双相过程，其特征是初始缺血损伤随后在再灌注时出现加剧的炎症反应。这些事件最终汇聚为多种受调控和不受调控的细胞死亡途径，包括坏死（necrosis）、凋亡（apoptosis）、坏死性凋亡（necroptosis）、铁死亡（ferroptosis）和焦亡（pyroptosis），它们共同导致进行性组织损伤和移植物功能障碍。
3.1 缺血期
在肝移植（LT）背景下，肝脏IRI的缺血期始于器官获取和保存期间，此时血流中断使肝细胞和非实质细胞缺乏氧气和营养。在低氧条件下，氧化磷酸化迅速崩溃，导致严重的ATP耗竭、线粒体功能障碍、细胞内离子失衡、钙超载，以及向无氧糖酵解和乳酸积累伴细胞内酸中毒的代谢转变。线粒体在介导缺血损伤中发挥核心作用：膜去极化和线粒体通透性转换孔（mPTP）开放加剧了生物能量崩溃并使细胞对死亡敏感。同时，缺血诱导的细胞应激促进损伤相关分子模式（DAMPs）的释放，触发常驻库普弗细胞的早期激活并启动无菌炎症信号通路。与此同时，肝窦内皮细胞（LSECs）对缺血表现出显著易损性，发生结构改变，促进微循环功能障碍、血管收缩和白细胞粘附增强。此外，低氧驱动的缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）稳定化调节炎症和代谢适应程序。
3.2 再灌注期
尽管再灌注对组织存活至关重要，但氧气的突然重新引入通过触发快速的氧化和炎症级联反应而矛盾地加剧了肝损伤。复氧诱导大量活性氧（ROS）爆发，主要由功能失调的线粒体、NADPH氧化酶和黄嘌呤氧化酶产生。过量的ROS促进脂质过氧化、蛋白质氧化、线粒体失稳和肝细胞死亡。同时，库普弗细胞和LSECs迅速获得促炎表型，其特征是释放TNF-α、IL-1β、IL-6和趋化因子，从而促进循环中性粒细胞的募集和激活。激活的中性粒细胞通过释放蛋白酶、ROS和中性粒细胞胞外陷阱（NETs）进一步加剧组织损伤，NETs已成为肝脏IRI中无菌炎症和微血管功能障碍的主要放大器。内皮激活还通过上调粘附分子（包括ICAM-1和VCAM-1）促进微血管功能障碍，促进白细胞粘附、窦性充血和肝灌注受损。同时，受损肝细胞释放的DAMPs激活先天Toll样受体（TLR）依赖性通路，从而持续产生细胞因子、募集白细胞和维持无菌炎症。
3.3 细胞死亡途径
坏死是一种由不可逆ATP耗竭驱动的非调控细胞死亡形式，线粒体是IRI中肝细胞损失的主要贡献者。坏死导致DAMPs不受控释放，激活库普弗细胞并募集中性粒细胞，放大无菌炎症。凋亡由线粒体功能障碍、氧化应激以及内源性和外源性caspase依赖性通路的激活触发。由于凋亡需要残余细胞内ATP，而严重ATP耗竭有利于坏死，两种途径在肝脏IRI期间经常共存。坏死性凋亡由RIPK1–RIPK3轴介导，促进炎症性坏死细胞死亡和DAMP释放。铁死亡以铁依赖性脂质过氧化和抗氧化防御受损为特征，已成为肝细胞和内皮损伤的关键驱动因素，尤其是在脂肪变性肝脏中。最后，由炎症小体激活、caspase-1裂解和gasdermin D（GSDMD）介导的焦亡，通过将细胞死亡与高度促炎细胞因子的释放偶联而促进肝损伤。
4. IRI肝脏中的生物标志物
肝脏IRI与多种生化、炎症和细胞死亡相关生物标志物的释放相关。血清转氨酶，特别是丙氨酸氨基转移酶（ALT）和天冬氨酸氨基转移酶（AST），仍是最广泛使用的肝细胞损伤指标。氧化应激标志物如丙二醛（MDA）积累和还原型谷胱甘肽（GSH）耗竭常用于评估脂质过氧化和抗氧化失衡。DAMPs，特别是HMGB1，已成为连接坏死细胞死亡与先天免疫激活和无菌炎症的关键介质。TNF-α、IL-1β和IL-6等细胞因子进一步反映无菌炎症反应的强度并与IRI严重程度相关，而中性粒细胞浸润标志物包括髓过氧化物酶（MPO）活性。Caspase-3/7活性常用作凋亡信号传导的指标，而4-HNE和MDA等脂质过氧化产物反映与铁死亡相关的氧化膜损伤。
5. 肝脏IRI的二维体外模型
5.1 二维单一培养
原代人肝细胞是研究肝脏IRI最相关的体外模型之一，因为它们再现了人肝脏的关键代谢和应激反应。Bhogal等人使用从肝切除术中分离的肝细胞作为离体模型研究氧化应激反应，观察到自噬和线粒体自噬诱导作为细胞保护反应。永生化肝细胞样细胞系因其低成本和易维护性而成为有效替代方案。Modis等人使用HepG2细胞系建立体外模型，评估腺苷及其代谢衍生物肌苷的保护作用。HL-7702正常肝细胞系也被用于研究肝损伤，研究人员开发了受控的低氧/复氧体外系统，发现促炎细胞因子表达与低氧持续时间成正比。肝星状细胞（HSCs）也被用于研究IRI相关的炎症和纤维化反应，LX-2细胞系研究表明BTLA激活与HSC激活之间存在直接关系。
5.2 共培养系统
共培养系统能够再现表征生理和病理过程的复杂细胞间相互作用。Lee等人将缺血-再灌注作为原代大鼠肝细胞的预处理手段，观察到了HGF和IGF-1等保护因子的释放增加。Chen等人采用肝细胞-间充质基质细胞（MSCs）共培养模型，证明MSC治疗改善肝细胞活力、减少ROS产生并促进TGF-β释放。另一项研究评估了预条件化人羊膜来源MSCs对M1样巨噬细胞和人肝细胞系THLE-2的影响。Pan等人建立了小鼠和人肝细胞与免疫细胞的双共培养系统，证明sEH抑制可减少氧化应激和促凋亡标志物表达。最近，利用人诱导多能干细胞（hiPSCs）分化获得的肝细胞与免疫细胞的共培养系统，鉴定出iRhom2是炎症反应的关键调节因子。
5.3 体外模型的挑战与局限
二维体外模型的主要局限是缺乏天然组织结构和生理微环境，这损害了肝细胞特异性功能的维持。这些系统难以再现免疫和血管成分，且肝细胞功能在培养中随时间下降。共培养系统虽有所改进，但仍缺乏完全定义的三维组织结构，无法再现组织水平的梯度如氧和营养分区以及生理灌注动力学。
6. 肝脏缺血-再灌注损伤的动物模型
6.1 小鼠
小鼠模型广泛用于研究肝脏IRI的分子和细胞机制。Wang等人建立了部分原位肝移植小鼠模型，再现冷IRI，证明延长冷缺血可加剧移植后损伤。近期研究利用相同方法证明冷保存应激触发LSECs中的铁死亡。大多数实验模型聚焦于温性部分缺血，通过临时夹闭供应左叶和中叶的肝动脉和门静脉约45-90分钟实现。研究表明Properdin抑制可减少肝损伤，丙泊酚预处理通过上调Nrf2/HO-1信号通路发挥肝保护作用，YAP在肝再生和纤维化中发挥关键作用，Sirt3抑制通过促进线粒体DNA释放和cGAS-STING通路激活加剧损伤。
挑战与局限：部分温缺血模型不能完全再现肝移植的临床场景，物种特异性差异限制转化应用，结果受手术技能、麻醉类型、缺血持续时间和品系依赖性易感性影响。
6.2 大鼠
大鼠模型因其较大的器官尺寸和更稳定的手术操作，允许更精确的血流动力学控制和微循环评估。Luo等人比较了四种急性肝脏IRI大鼠模型的方法学差异。大鼠模型广泛用于评估药理学化合物，包括脂肪来源间充质基质细胞（AMSCs）、川芎嗪、间充质干细胞来源细胞外囊泡、伏立诺他（SAHA）、红景天苷、仙茅苷、富马酸二甲酯和姜黄素等。离体灌注大鼠肝制备也被用于研究冷保存和再灌注损伤。
挑战与局限：实验方案异质性使研究间直接比较困难，标准部分缺血模型不能完全再现肝移植相关的完全血管闭塞和血流动力学应激，物种间细胞死亡途径差异限制转化相关性。
6.3 猪模型
猪模型被认为是最具转化相关性的实验动物模型，因其在器官大小、血管结构、凝血途径和免疫功能方面与人肝脏生理高度相似。Maione等人证明猪离体肝灌注模型可充分模拟肝移植条件。Czigany等人提供了腺苷A2a受体激动剂在猪DCD肝移植模型中保护作用的体内证据。低剂量促红细胞生成素-α在猪移植模型中显示出部分细胞保护作用。人骨髓间充质基质细胞（BMSCs）通过门静脉输注显示优越保护效果，脂肪来源干细胞（ADSCs）减少炎症并增强再生。
挑战与局限：物种特异性差异仍存在于免疫调节、线粒体反应、受体表达和代谢信号传导中。高成本、伦理考量、后勤复杂性和程序限制制约了样本量和实验灵活性。大多数研究依赖年轻健康动物，不能反映临床现实中供体器官和患者常伴有高龄、脂肪变性、肝硬化等合并症的情况。
7. 三维模型作为研究肝脏IRI的潜在工具
三维培养系统作为介于简化体外模型和复杂体内动物系统之间的中间平台。肝球体由自聚集的肝细胞组成，通常与非实质细胞结合，与二维培养相比显示出改善的活力和长期功能性。肝类器官来源于成体或多能干细胞，通过自组织形成组织样结构。2026年Rezvani等人开发了人多能干细胞来源的胎肝样类器官（FLOs），能够同时分化肝和免疫谱系。Cimino等人开发了患者来源肝类器官模型，将其置于冷缺血和再灌注条件下。肝类组装体是更先进的人源三维平台，允许整合多个细胞区室。Yuan等人开发了人肝类组装体，再现门静脉周围区域的肝脏特征。Lu等人利用DNA折纸工程化核酸细胞连接器构建三维肝类器官模型，在氧化应激诱导后再现了肝脏IRI的关键特征。肝芯片（LOC）平台将三维构建体与微流体灌注相结合，模拟生理氧梯度、营养交换和流动动力学。三维生物打印技术能够实现肝细胞和非实质细胞在预定义架构中的空间受控组装。
问题驱动实验模型选择：模型选择应由生物学或转化问题驱动，而非仅由结构复杂性驱动。还原论体外系统适合机制通路发现和高效药物筛选，共培养和多细胞三维系统在炎症信号和实质-非实质细胞相互作用为核心问题时更有价值，动物模型对于研究血管、免疫和系统反应仍然重要。
8. 结论
三维肝脏模型代表了有前景的中间平台，结合了体外系统的实验可及性与增强的结构和功能保真度。这些系统通过更准确地再现组织、细胞间通讯和功能异质性，有潜力在特定研究应用中补充常规体外和动物模型。三维肝脏模型的采用有助于克服与动物实验相关的伦理和立法限制，符合3Rs原则。尽管在肝脏IRI机制理解方面取得了实质性进展，临床前发现向有效临床干预的转化仍然有限，这反映了模型局限性、受控损伤环境与临床移植差异、生物异质性、实验终点选择和治疗靶点多因素性质等多重相互关联因素。先进三维系统代表了肝脏IRI研究中有前景的互补模型，进一步验证和与既有实验模型的直接比较对于确定其预测价值和转化潜力至关重要。
