布基纳法索水稻中分离的 10 个完整弯孢菌基因组测序

《Microbiology Resource Announcements》：Sequencing of 10 complete Curvularia genomes isolated from rice in Burkina Faso

　　

摘要

水稻正面临由弯孢霉属真菌引起的新发疾病攻击。已从水稻中分离出 21 个物种。其中，8 个物种引起褐斑病，目前仅有 13 条完整的基因组序列可用。我们制备了 10 条从病株水稻中分离的弯孢霉菌株的基因组序列。

通告

水稻是世界上半数人口的主食，也是种植范围第二广的谷物 (1)。其产量受到几种病原体的制约。曾经被认为次要的弯孢霉属真菌似乎正成为新出现的威胁。据报道，8 种弯孢霉会在叶片和种子上引起褐色至黑色斑点，并导致水稻小穗腐烂 (2–4)。据我们所知，已从水稻中分离出 21 种弯孢霉，数据库中仅有 13 个基因组可用。为了鉴定和表征西非水稻上存在的弯孢霉物种，我们制备了额外的完整基因组序列。2021 年和 2022 年在布基纳法索采集了有症状的水稻种子和叶片 (表 S1, https://doi.org/10.18167/DVN1/4WHJAJ)，并在 25°C 下置于湿润滤纸上，光/暗周期为 12/12 小时，培养 3 至 5 天。进行了单孢子分离。为了提取 DNA 制备菌丝体，将 271 个分离物在覆盖有玻璃纸圆片的马铃薯葡萄糖琼脂 (PDA) (39 g/L) 上于 25°C 培养 7 天。使用十六烷基三甲基溴化铵 (CTAB) 从 60 mg 菌丝体中提取 DNA (5)，并用于制备测序基因分型 (GBS) 文库。使用 Atropos 应用质量过滤器 (Phred 得分阈值为 20) (6)，并使用 FastQC 评估读段质量 (7)。GBS 数据允许将 33% 的分离物归类到物种并进行分组。从这些组中，选择了 10 个分离物进行全基因组测序。通过 BLASTN 从组装的基因组中提取 GAPDH 和 TEF 基因序列 (8)，并与 80 个菌株的序列进行比对，这 80 个菌株对应 74 个弯孢霉物种，代表了参考文献 9, 10 建立的系发育树。使用 phylogeny.fr 流水线的“一键”模式独立重建每个基因的系发育树 (11)。新测序的菌株根据最近参考菌株的物种名称被归类为Curvularia pisi、C. soli、C. dactylocteniicola和C. homomorpha，在 GAPDH 和 TEF 系发育树中保持一致。

基因组 DNA 通过 CTAB 法从液体 PDA 中产生的菌丝体中提取 (5)。使用 Novogene NGS DNA 文库制备试剂盒制备文库，并通过 Illumina NovaSeq 6000 合成测序获得 150 bp 双端序列。基因组 DNA 通过超声破碎至约 350 bp。末端修复、加腺苷、接头连接、PCR 富集和 AMPure XP 纯化后，读段质量的评估方式与 GBS 数据集类似。使用 ABySS v2.2.1 (12) 执行组装，使用默认设置，k-mer 大小从 20 到 90，步长为 10。为每个菌株选择产生最高 N50 的 k-mer 值。仅保留长度大于 500 bp 的支架。使用 AF129745.1、AF129746.1、KU749293 和 KU749294 进行 tBLASTN 搜索，从组装结果中检索交配型序列。基因组长度范围为 31.4 至 33.8 Mb，支架数量从 107 到 1,424，鸟嘌呤 - 胞嘧啶 (GC) 含量从 50 到 51% (表 1)。使用 BUSCO V5.4.3 和 Pleosporales 数据集 (13) 评估的基因组完整性显示，组装结果恢复了 Pleosporales 目中预期的超过 93% 的单拷贝基因。组装良好的Curvularia clavata YC1106 基因组，其完整性值 (94.1%) 与我们基因组的值实际上相同。

表 1

表 1 完整基因组序列的一般特征

?	测序					组装					BUSCO 分析
菌株	登录号	推定物种	交配型	读段数	覆盖深度 (×)	k-mer 值	支架数	大小 (bp)	GC 百分比	N50 (bp)	完整百分比	完整且单拷贝百分比	完整且重复百分比	碎片化百分比	缺失百分比
BF9368	CBCPGI010000000	C. pisi	MAT2	19,910,372	93.3	90	649	32,973,020	50	332,130	94.3	94.2	0.1	0.4	5.3
BF9418	CBCPGN010000000	C. pisi	MAT2	14,875,960	69.7	80	499	32,026,321	51	270,592	94.2	94.1	0.1	0.4	5.4
BF9436	CBCPGH010000000	C. soli	MAT2	15,567,580	72.9	80	107	31,887,855	51	1,119,627	94.1	93.9	0.2	0.3	5.6
BF9445	CBCPGJ010000000	C. dactylocteniicola	MAT2	15,989,204	74.9	80	893	33,739,466	51	282,021	94.4	94.1	0.3	0.3	5.3
BF9478	CBCPGG010000000	C. soli	MAT2	14,530,142	68.1	80	121	31,949,106	50	1,272,017	94.2	94.0	0.2	0.3	5.5
BF9509	CBCPGP010000000	C. dactylocteniicola	MAT2	17,749,258	83.1	70	1424	33,868,822	51	199,026	94.4	94.1	0.3	0.3	5.3
BF9539	CBCPGK010000000	C. homomorpha	MAT1	13,822,238	64.7	80	516	31,404,743	51	351,434	94.2	94.0	0.2	0.3	5.5
BF9580	CBCPGL010000000	C. homomorpha	MAT2	18,885,786	88.5	90	468	32,097,874	51	506,840	94.5	94.3	0.2	0.3	5.2
BF9594	CBCPGM010000000	C. pisi	MAT1	17,782,708	83.3	70	605	32,205,552	51	283,458	94.2	94.1	0.1	0.2	5.4
BF9599	CBCPGO010000000	C. pisi	MAT2	17,083,588	80.0	70	714	31,935,217	51	200,537	94.2	94.1	0.1	0.4	5.4

致谢

本工作得到了布基纳法索法国大使馆、CIRAD 和 LMI Patho-Bios 的资金支持。