Rbp-Jκ通过染色质景观重塑调控NK细胞晚期成熟与迁移

《Proceedings of the National Academy of Sciences》：Rbp-Jκ controls NK cell late maturation and migration via chromatin landscape remodeling

　　

尽管Rbp-Jκ作为Notch信号通路的主导转录调节因子作用明确，但其在自然杀伤（NK）细胞中的细胞内在功能仍不清楚。研究人员整合基因消融（Ncr1iCre × Rbp-Jκfl/fl）研究，联合单细胞RNA测序（scRNA-seq）、单细胞转座酶可及染色质测序（scATAC-seq）、批量ATAC-seq、CUT&Tag及功能实验，阐明Rbp-Jκ调控NK细胞的机制。结果表明，Rbp-Jκ通过编排NK细胞染色质重塑，控制其成熟、效应功能与迁移。机制上，Kruppel样因子2（Klf2）作为Rbp-Jκ的关键下游转录效应因子，调控NK细胞成熟与迁移。该发现确立Rbp-Jκ为连接发育检查点与效应功能的中心调节因子，为提高NK细胞生成及肿瘤浸润提供策略。

研究背景与立项依据：自然杀伤（NK）细胞是Ⅰ类固有淋巴样细胞（ILC1s）亚群，在抗病毒与早期抗肿瘤监视中发挥关键作用。NK细胞由骨髓共同淋巴样祖细胞经NK前体（NKP）、未成熟NK（iNK）至成熟NK（mNK）逐步分化，并依CD27与CD11b表达划分为CD27⁺CD11b^?、CD27⁺CD11b⁺及CD27^?/lowCD11b⁺阶段，成熟后迁出骨髓巡逻外周组织。Notch信号核心转录因子Rbp-Jκ（小鼠源CSL）在T、B细胞中功能明确，但既往全造血或ILC1谱系删除模型结论不一，且在NK细胞指定后其细胞内在作用未知。为此，研究人员构建Ncr1^iCre × Rbp-Jκ^fl/fl（Rbp-Jκ^ΔNK）小鼠，专门在NK细胞定型后删除Rbp-Jκ，结合多组学与功能实验揭示其机制。该论文发表于《Proceedings of the National Academy of Sciences》。

主要关键技术方法：研究人员使用Ncr1^iCre × Rbp-Jκ^fl/fl小鼠与同窝对照，分选骨髓CD45⁺CD3^?CD19^?CD122⁺细胞进行scRNA-seq与scATAC-seq，对脾NK细胞行批量ATAC-seq及Rbp-Jκ/Klf2的CUT&Tag，并以ChIP–qPCR验证结合；体内采用B16F10肺转移模型与竞争性归巢过继转移实验，体外行NK亚群与RMA-S/YAC-1共培养杀伤及CD107a脱颗粒检测，辅以流式定量成熟亚群与归巢分子（CD62L、S1pr5、Cx3cr1、CXCR4）。

研究结果

Rbp-Jκ Deficiency Impairs NK Cell Maturation and Migration：流式显示Rbp-Jκ^ΔNK小鼠骨髓Lin^?CD122⁺及NK细胞增多，而脾、外周淋巴结、外周血、肝中NK细胞减少；脾NK细胞CD62L下调，S1pr5与Cx3cr1蛋白降低，CXCR4保留。CD27/CD11b分型示CD27^?CD11b⁺成熟亚群减少、CD27⁺CD11b^?未成熟亚群积累，终末CD43⁺KLRG1⁺比例下降，表明Rbp-Jκ缺失阻滞NK细胞晚期成熟并削弱向外周迁移。

Rbp-Jκ^ΔNK Mice Exhibit Impaired Tumor Control Due to Defective NK Cell Migration：B16F10静脉攻击后Rbp-Jκ^ΔNK肺转移结节增多；肺内总NK及CD62L⁺NK减少。竞争性过继（CellTrace Violet/CFSE标记1:1混合）入荷瘤野生鼠18小时后，缺陷NK在肺肿瘤灶占比下降。虽肺NK高表达CD226、NKG2D且CD107a⁺比例升高，但IFN-γ、颗粒酶B、穿孔素未变；体外DP与CD11bSP亚群对RMA-S杀伤增强而对YAC-1无差异。结论：Rbp-Jκ缺失NK呈激活表型但因迁移障碍致体内抗肿瘤失效。

Single-Cell Profiling Reveals Direct and Indirect Rbp-Jκ-Dependent Regulation of Chromatin Remodeling in NK Cells：scRNA-seq分4亚群（CD27SP、DP early、DP late、CD11bSP），CytoTRACE示DP early发育潜能评分降低而CD11bSP异常升高。DEGs富集于趋化因子信号、NK杀伤通路上调，核糖体与氧化磷酸化下调；scATAC-seq差异可及区（DARs）多居启动子，成熟亚群丢失迁移相关通路（白细胞跨内皮迁移）而获得效应通路开放。440个含Rbp-Jκ基序的DAR重叠基因为直接靶标，Rbp-Jκ直接抑制激活/杀伤基因、直接激活少量迁移基因（含Klf2、S1pr5、Ccl5）。

Multiomics Analysis Implicates Klf2 as a Key Rbp-Jκ Effector in NK Cell Maturation and Migration：SCENIC与chromVAR一致显示Klf2调控子活性在缺陷NK各亚群降低。Klf2 CUT&Tag与批量ATAC交集示78.0% Klf2位点与对照开放区重叠（缺陷型仅33.5%）。Klf2靶基因涵盖S1pr5、Cx3cr1、Id3；ChIP–qPCR证实Klf2结合S1pr5、Cx3cr1、Id3启动子；60.3% Rbp-Jκ正调靶标与Klf2顺式靶标重叠，确立Klf2为枢纽效应因子。

Rbp-Jκ Directly Regulates Klf2 Transcription in NK Cells：scATAC示Klf2内含子/增强子区在对照开放度高；qPCR与免疫印迹确认Klf2 mRNA及蛋白在缺陷NK降低。ChIP–qPCR定位Rbp-Jκ结合Klf2启动子?1306~?1299 bp（CCCCGCCC模体）；Klf2过表达慢病毒回补Rbp-Jκ^ΔNK脾NK后，Klf2转录回升，CD62L与CX3CR1表面蛋白恢复。结论：Rbp-Jκ直接转录激活Klf2，经Klf2–S1pr5/Cx3cr1轴控迁移与成熟。

讨论与结论翻译：本研究界定Rbp-Jκ为NK细胞成熟、迁移与激活的守门者，通过染色质重塑协调上述过程。相较于既往全造血删除模型，Ncr1-iCre特异性敲除揭示其细胞内在地参与晚期成熟、迁移与效应，调和了既往矛盾报道。整合scRNA-seq与scATAC-seq表明Rbp-Jκ主导染色质可及性动态，Klf2为其核心转录效应器，直接控制成熟与迁移。迁移介质（S1PR5、CX3CR1、CD62L）下调伴CXCR4维持，解释缺陷NK在骨髓蓄积及向外周/肿瘤归巢减弱；尽管呈非耗竭激活表型，其肿瘤浸润受损。多组学示染色质失调随成熟进展加剧，早期影响分化/迁移位点、成熟群效应基因（Il2rb、Klrb1c、Runx1）开放度反常升高而迁移基因（S1pr1、S1pr5、Xcl1）开放度降低。Rbp-Jκ直接靶标虽有限但功能特异，其中Klf2介导其对S1pr5、Cx3cr1的调控，ChIP证实Rbp-Jκ结Klf2启动子、Klf2结S1pr5/Cx3cr1启动子，二者共占靶标达60.3%，形成转录复合体；Klf2过表达挽救CD62L与CX3CR1。综上，Rbp-Jκ经染色质重塑调控Klf2驱动程序，耦合NK成熟与迁移适配性，为提升NK生成效率与肿瘤浸润提供治疗思路。