针对功能性巨噬细胞的纳米平台，用于特异性清除细胞内的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌

《Colloids and Surfaces B: Biointerfaces》：Functional Macrophage-Targeted Nanoplatform for Specific Eradication of Intracellular Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus

　　

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  通过甘露糖-PDA结合开发的靶向巨噬细胞的CaCO?纳米平台。
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  由酸性细胞内MRSA环境触发的pH响应性万古霉素释放。
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  通过甘露糖-甘露糖受体识别实现巨噬细胞摄取增强。
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  在体外和体内均证明了有效的细胞内MRSA清除效果。
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  用于精确细胞内病原体治疗的功能性无机纳米载体方法。

引言

金黄色葡萄球菌是一种主要的革兰氏阳性机会性病原体，可引起多种社区获得性和医院获得性感染，从皮肤和软组织感染到严重的侵袭性疾病，如菌血症、感染性心内膜炎、骨髓炎和败血症[1] [2]。耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌（MRSA）由于其多重耐药性及其建立持续感染的能力，进一步增加了临床治疗的复杂性[2]。越来越多的证据表明，金黄色葡萄球菌不仅仅是一种细胞外病原体，它还可以侵入、存活并在多种宿主细胞类型内复制和持续存在，包括巨噬细胞[3]。值得注意的是，对191株临床金黄色葡萄球菌分离株的系统性分析显示，细胞内侵袭是来自骨和关节感染、菌血症以及感染性心内膜炎的分离株的普遍特征[3]。一旦被内化，一部分金黄色葡萄球菌可以进入生长缓慢或类似持续存在的状态，这种状态的特点是对抗生素具有短暂的耐受性，从而为治疗失败、慢性感染和疾病复发提供了潜在原因[4] [5]。

因此，有效治疗细胞内MRSA需要抗菌剂充分渗透到受感染的宿主细胞中，并在细胞内细菌生态位中维持治疗有效的浓度。然而，传统抗生素通常表现出膜通透性不足、细胞内稳定性有限、分布不均，或在细胞内微环境中抗菌活性降低，导致细胞内细菌无法充分接触活性药物[6] [7]。因此，基于纳米医学的递送策略作为一种有前景的方法应运而生，通过增强细胞内化、延长细胞内药物保留时间，并在细胞内感染部位实现刺激响应性释放来克服这些药代动力学障碍[6]。例如，经过甘露糖修饰的外泌体能够被巨噬细胞优先摄取，用于递送溶葡萄球菌酶和万古霉素（Van），从而显著清除细胞内的静止MRSA[8]。同样，模仿细菌的载有Van的纳米药物可以增强巨噬细胞的摄取和细胞内保留，并在细胞内酸性条件下释放Van，从而改善细胞内MRSA的清除[9]。最近，双靶向多胺（poly(amino acid）纳米颗粒实现了对细胞内金黄色葡萄球菌持续存在者的原位抗生素递送，增加了细胞内抗生素的积累并克服了微环境相关的药物耐受性[10]。同时，非抗生素纳米治疗策略，包括协同光热和光动力平台，在对抗耐药MRSA感染方面显示出相当大的潜力[11]。除了纳米颗粒系统外，最近的抗菌水凝胶和载药微针平台也进一步证明了合理的生物材料设计可以将持续的抗菌递送与局部组织保护和再生功能结合起来[12] [13] [14]。

在无机纳米载体中，碳酸钙（CaCO?）因其良好的生物相容性、药物结合能力、生物降解性以及对酸性环境的物理化学响应性而受到广泛关注[15] [16]。已经证明CaCO?纳米颗粒能够有效结合治疗分子并调节药物释放行为[15]，而基于CaCO?的纳米结构在轻微酸性条件下可以快速降解，为pH响应性药物递送提供了有用的基础[16]。然而，裸露的CaCO?纳米颗粒本身不具备细胞选择性识别能力，因此需要额外的表面功能化以实现靶向细胞内递送。多巴胺（PDA）的引入提供了一种多功能纳米颗粒表面改性策略，因为多巴胺可以很容易地在预先形成的纳米颗粒表面上聚合，随后形成的PDA层可以与各种功能性配体反应[17]。此外，PDA涂层可以改善加载的亲水分子的保留，并有助于实现持续的、pH依赖性的药物释放[18]。因此，将多孔CaCO?与PDA结合，提供了一种模块化的纳米载体架构，兼具药物结合、减少药物过早泄漏、酸响应性释放和方便的表面功能化[15] [16] [17] [18]。

甘露糖受体（MR；也称为CD206或MRC1）是一种由巨噬细胞表达的C型凝集素受体，能够识别含甘露糖的糖缀合物并介导受体依赖的内化[19] [20]。结构研究阐明了CD206识别碳水化合物的分子基础[19]，而原代骨髓来源的巨噬细胞的遗传和功能研究直接证明了MRC1介导的含碳水化合物配体的摄取[20]。甘露糖介导的巨噬细胞靶向也被证明可以增加含Van的抗菌制剂的细胞内递送[8]。因此，我们假设对载有Van的CaCO?/PDA纳米平台进行甘露糖功能化可以增强巨噬细胞的内化，增加细胞内Van的积累，并提高对抗细胞内MRSA的抗菌效果。在本研究中，将Van加载到多孔CaCO?纳米颗粒中，然后进行PDA涂层和处理，并与合成的甘露糖-NBD配体结合，构建了靶向巨噬细胞、pH响应性的纳米平台CaVPM。我们系统地评估了其物理化学性质、Van的加载和释放、巨噬细胞靶向行为、细胞内药物积累、抗MRSA活性、生物学分布、组织相容性和治疗效果。

章节片段

材料与方法

有关材料、甘露糖-NBD配体（Man-NBD）的合成、CaCO₃、CaV、CaVP和CaVPM的制备、物理化学表征、细胞实验、抗菌测定和动物研究的详细信息，请参见补充信息。

CaVPM的构建和物理化学表征

CaCO?纳米颗粒是使用多巴胺介导的气体扩散方法制备的[16]。透射电子显微镜（TEM）显示其具有多孔球形结构（图2A），粒径分布集中在约225纳米（图2C）。能量dispersion spectroscopy（EDS）元素映射进一步确认了预期的元素组成和颗粒内的均匀分布（图2B）。多孔形态为Van的吸附提供了较大的内外表面积。在初步的UV–Vis加载测试中，

结论

开发了一种靶向巨噬细胞、pH响应性的CaCO?/PDA纳米平台，以改善细胞内Van对MRSA的递送效果。甘露糖功能化增加了RAW264.7巨噬细胞的摄取，载体的酸性释放特性使得在轻微酸性条件下能够快速释放Van。这些特性增强了细胞内Van的暴露量，并在细胞和小鼠感染模型中改善了细胞内MRSA的清除效果。溶血和主要器官的组织学检测

动物伦理声明

所有动物实验均按照陆军医科大学（重庆）的《实验室动物护理和使用指南》进行，并获得了陆军医科大学动物伦理委员会的批准（批准编号20170002）。

利益冲突

作者声明没有利益冲突。

统计分析

所有治疗组的平均值±标准差均已确定。统计分析采用Student’s t检验（双尾）或单因素方差分析（one-way ANOVA）。*P ≤ 0.05、**P ≤ 0.01和***P ≤ 0.001用于表示统计显著性。

支持信息

材料和方法。合成化合物的¹H NMR、¹³C NMR和HRMS光谱。不同浓度的CaCO₃和CaVPM与293T、HUVEC、RAW264.7和L02共孵育72小时的体外细胞毒性测试。

CRediT作者贡献声明

王志鹏：撰写 – 审稿与编辑，监督。何云：撰写 – 审稿与编辑，监督。邓新月：软件，数据管理。魏奇军：实验研究。龚宏志：验证，软件。詹婷：可视化，软件，实验研究。张瑞雪：撰写 – 初稿，实验研究，数据管理。黄超：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 初稿，可视化。谢北北：验证，监督。

作者声明没有已知的可能影响本文工作的竞争性财务利益或个人关系。

致谢

本研究得到了国家自然科学基金 [编号32401119]、四川省自然科学基金 [编号2023NSFSC2000]、重庆市科学技术局[编号CSTB2024NSCQ-LZX0055; CSTB2025TIAD-QQZDQXXCZXBFFX0007; CSTB2024NSCQ-MSX1002; CSTB2025TIAD-KPXO090]的支持。

Ruixue Zhang|Ting Zhan|Hongzhi Gong|Qijun Wei|Xinyue Deng|Beibei Xie|Yun He|Zhi-Peng Wang|Chao Huang