草甘膦作为乙酰胆碱酯酶抑制剂：一项多尺度计算研究

《Computational Toxicology》：Glyphosate as an acetylcholinesterase inhibitor: A multiscale computational study

　　**摘要**
本研究评估了草甘膦作为乙酰胆碱酯酶（AChE）潜在抑制剂的作用，以经典的有机磷化合物为参考，并采用了一种多尺度计算策略，包括分子对接、概念密度泛函理论（CDFT）、量子分子力学（QTAIM）分析以及带有伞形采样的量子力学/分子力学（QM/MM）模拟。草甘膦与AChE催化活性位点的对接显示，其磷原子相对于催化Serine的位置并不理想。基于CDFT导出的反应性描述符（ωB97X-D/6–311?+?G* 理论水平）构建的五变量QSAR模型，对33种含有O=P–O片段的ChEMBL来源的有机磷化合物进行了分析，得到了良好的内部验证结果（R2?≈?0.92，Q2LOO?≈?0.89，Q2LMO?≈?0.88），其中亲电性（ω）和磷原子周围的局部电子环境被认为是影响活性的主要因素。该模型预测草甘膦的IC50值位于毫摩尔范围内。使用DFTB+/CHARMM36对中性非两性分子草甘膦进行的QM/MM伞形采样分析表明，其作用机制可能涉及两步关联过程；与soman-AChE参考机制的直接比较显示，草甘膦的磷酸化步骤需要显著更高的活化能。在本研究中模拟的中性草甘膦反应被视为最大反应性、最低能垒的参考状态；此外，达到这种活性的质子化膦酸状态的额外热力学成本会进一步增加有效障碍。总体而言，对接、QSAR和QM/MM的结果均表明，尽管草甘膦通过共价磷酸化抑制AChE在机制上是可行的，但在生理条件下效率较低。这些结果为实验报告中观察到的较低抑制活性提供了计算上的解释。

**引言**
草甘膦是全球使用最广泛的除草剂之一，由于在现代农业系统中的大量应用，其在土壤、水体和沉积物中的含量不断增加[1]。最近的研究表明，草甘膦可以在环境中长期存在，并对土壤微生物群、水质及多种水生生物产生影响[2]。此外，它还可能引发氧化应激，改变生态平衡，并影响暴露生态系统中的生物多样性[3]，[4]。这些发现引发了关于其环境风险的科学和监管争议。
乙酰胆碱酯酶（AChE）是胆碱能神经系统中的关键酶，负责快速水解神经递质乙酰胆碱并终止突触信号传导[5]。结构上，AChE具有α/β水解酶结构，其活性位点位于一个约20??深的催化腔内，该腔由芳香族和带电氨基酸残基组成，形成了高度 electronegative 的环境。活性位点包含催化三联体Ser200-His440-Glu327（基于Torpedo californica AChE的编号系统），以及由Gly118、Gly119和Ala201形成的“氧阴离子孔”[6]。AChE通过两步机制水解乙酰胆碱：首先Ser200被酰基化，然后通过水分子介导的去酰基化反应完成。
除了其生理功能外，亲核性的Ser200使AChE成为多种共价抑制剂的目标，尤其是有机磷化合物。这些化合物会不可逆地磷酸化Ser200残基，形成稳定的膦酸-酶加合物，阻止乙酰胆碱的水解，导致该神经递质积累，从而引起突触过度刺激、神经肌肉麻痹甚至死亡[7]，[8]，[9]。神经毒性有机磷化学武器（沙林、索曼、塔布恩和VX）是典型的AChE抑制剂：它们的抑制速率接近酶扩散控制的极限，并且具有极高的毒性[10]。另一方面，许多农业用有机磷化合物在全球范围内被广泛使用，对人类和野生动物构成长期暴露的风险。
与通常含有氟或芳基等离去基团并通过抑制胆碱酯酶发挥作用的经典有机磷化合物不同，草甘膦在结构上与氨基酸（源自甘氨酸）相关，主要通过抑制莽草酸途径中的5-烯醇吡喃糖基-3-磷酸合成酶起作用[11]。传统上，草甘膦不被认为是一种有效的AChE抑制剂。在体外条件下，只有在非常高浓度（毫摩尔级别）时，草甘膦才会弱抑制AChE活性[12]，[13]。然而，一些毒理学研究报道了草甘膦制剂的影响，包括氧化应激和胆碱酯酶活性的轻微降低[14]，[15]。需要注意的是，这些观察结果涉及复杂的商业制剂，不能简单地归因于草甘膦分子本身的直接共价磷酸化；间接机制、助剂效应和非共价相互作用也可能起作用。这些发现引出了以下机制性问题：原则上，作为孤立的膦酸物种的草甘膦是否可以通过共价磷酸化抑制AChE？如果是这样，这一途径在分子层面的能量和几何要求是什么？
草甘膦由化学家John E. Franz于1970年首次合成，并于1974年以Roundup品牌上市[16]。它含有氨基、羧酸和膦酸基团，使其具有两性多酸特性。在水溶液中，草甘膦根据pH值的不同存在不同的离子形式，具有四个解离常数（pKa）：在25?°C时分别约为2.0、2.6、5.6和10.6[17]，[18]。因此，草甘膦可以存在于多种质子化微状态下：（i）中性非两性形式，（ii）中性两性形式，以及（iii）阴离子形式（净电荷为?1）。每种状态可能与生物靶标的相互作用方式和化学反应性不同。为了像典型的有机磷化合物一样通过共价方式抑制AChE，草甘膦必须位于酶的活性位点，使其亲电性磷原子能够被Ser200的亲核攻击，并且必须有一个在加成步骤后离开的离去基团。对于像索曼这样的神经毒性有机磷化合物，离去基团是容易离解的氟原子；而对于缺乏卤素或其他良好共价离去基团的草甘膦，可能的机制涉及从膦酸中消除一个–OH基团，这需要先进行质子化才能以水（H2O）的形式释放[3]。
鉴于这些过程的复杂性，多尺度计算研究尤为重要。近几十年来，混合量子力学/分子力学（QM/MM）方法已被 entwickelt，用于在原子层面详细阐明酶的机制。在这种方法中，形成的化学键使用QM描述，而系统的其余部分（大部分酶、溶剂等）则使用经典MM处理，从而可以在可承受的计算成本下模拟完整的生物环境中的反应[19]，[20]。例如，之前关于AChE与有机磷化合物相互作用的研究使用了QM/MM分子动力学模拟和自由能采样来表征沙林和索曼等神经毒素对Ser200的磷酸化[21]，[22]。在索曼（pinacolyl methyl-phosphonofluoridate）的情况下，Sirin和Zhang[22]报告了一种加成-消除机制，形成三角双锥五价中间体，随后发生PF键断裂，过渡态自由能分别为约5.6和9.6?kcal?mol?1。这种关联机制与经典的协同位移假说不同，为评估半经验QM/MM协议提供了有用的参考。
本研究进行了一项全面的计算分析：（i）评估草甘膦与AChE催化位点的结合几何结构（预组织）和亲和力，并将其与一组已知半最大抑制浓度（IC50）值的有机磷化合物进行比较；（ii）分析基于概念密度泛函理论（CDFT）导出的全局和局部反应性描述符（如电子亲和力、电离势、电/亲核性指数和Fukui函数等），重点关注膦酸基团的趋势；（iii）利用从头算QM/MM模拟探索可能的磷酸化机制，估算自由能轮廓并表征中间体和过渡态。通过这种方法，确定了活性位点的关键相互作用、关键几何参数（距离和角度）以及草甘膦的局部反应性（包括量子分子力学[QTAIM]的拓扑描述符），并与参考有机磷抑制剂进行了比较。总体而言，本研究的目的是探讨草甘膦作为孤立膦酸物种是否可以通过共价磷酸化抑制AChE，以及其效率如何，并从计算上解释实验中观察到的温和的AChE抑制活性，同时评估在理想化反应微态下共价磷酸化的化学可行性。本研究的新颖之处在于将四种独立的计算方法（分子对接、QSAR、CDFT/QTAIM和QM/MM）整合到一个一致的多尺度框架中。

**计算方法**
为了比较草甘膦与其他磷化合物在AChE催化位点上的活性和电子反应性，使用了从ChEMBL v26导出的处理过的AChE生物活性表[23]。公共工作流程生成了acetylcholinesterase_04_bioactivity_data_3class_pIC50.csv文件，其中检索了人类AChE的IC50记录（target_chembl_id?=?CHEMBL220），并将标准化的IC50值转换为pIC50。然后，使用了一个针对催化Serine处的亲核攻击的结合几何结构和预组织的子结构过滤器。

**AChE催化腔的对接筛选**用于定性评估预组织情况，重点关注P···Oγ(Ser200)距离、假定离去基团的取向以及与氧阴离子孔残基（Gly118、Gly119和Ala201）的接触。由于草甘膦的高度极性，其结合受到质子化和静电相互作用的影响很大，而标准的AutoDock4评分函数在这些条件下的优化效果不佳，因此报告的ΔG值可能不准确。

**结论**
本研究应用的三层计算方法（分子对接、基于CDFT/QTAIM的QSAR和DFTB+/CHARMM36 QM/MM伞形采样）得出的结果支持了一致的机理解释。对接分析显示，草甘膦在AChE催化位点的几何预组织并不理想。P···Oγ(Ser200)距离和膦酸的取向与参考有机磷抑制剂（如索曼）明显不同，表明草甘膦的抑制机制可能与后者不同。

**作者贡献声明**
Juan E. López-Cervantes：形式分析、数据整理、概念化。
Carlos Z. Gómez-Castro：撰写-审稿与编辑、研究。
Luis A. Zárate-Hernández：可视化、软件。
Rosa L. Camacho-Mendoza：撰写-初稿、研究。
Simplicio Montiel-González：撰写-审稿与编辑。
José M. Vásquez-Pérez：软件、数据整理。
Marco A. Franco-Pérez：撰写-审稿与编辑、资源准备。
Julián Cruz-Borbolla：撰写-审稿与编辑。

**伦理批准**
本研究未涉及人类或动物实验；因此，不需要伦理批准、参与同意或发表同意。

**资助**
作者感谢SECIHTI的资助（项目编号CBF-2025-G-568）。

**利益冲突声明**
作者声明没有已知的可能影响本文工作的财务利益或个人关系。

**致谢**
作者感谢墨西哥科技、人文、技术与创新部（SECIHTI）的财政支持。J.E.L.-C. 感谢SECIHTI提供的MChem奖学金（编号4017454）。作者衷心感谢LANCAD和SECIHTI在LSVP UAM-Iztapalapa、DGTIC-UNAM和CGSTIC-Cinvestav提供的计算资源，包括Yoltla、Miztli和Xiuhcoatl超级计算机的使用机会。

**作者名单**
Juan E. López-Cervantes | Carlos Z. Gómez-Castro | Luis A. Zárate-Hernández | Rosa L. Camacho-Mendoza | Simplicio Montiel-González | José M. Vásquez-Pérez | Marco A. Franco-Pérez | Julián Cruz-Borbolla